论文部分内容阅读
发酵虫草菌粉是从冬虫夏草中分离提取的药用菌株经液体深层发酵加工得到的菌粉,研究表明酵虫草菌粉化学成分与冬虫夏草相似,主要含有核苷类、甾醇类、多糖类、氨基酸类、醇类、鞘脂类等化学成分,但成分含量存在差异。市场上发酵虫草菌粉类产品种类繁多,但尚无统一的质量控制标准,导致产品的质量参差不齐。《中国药典》2015版已收载了金水宝胶囊(片)和百令胶囊的质量标准,金水宝胶囊(片)质量标准为:薄层色谱法鉴别3种核苷、氨基酸、甘露醇;HPLC法鉴别5种核苷;HPLC测定腺苷和麦角甾醇的含量。百令胶囊的质量标准为:薄层色谱鉴别麦角甾醇;HPLC法鉴别6种核苷和3种氨基酸;氨基酸分析仪测定总氨基酸含量;滴定法测定甘露醇含量;HPLC法测定腺苷含量。甾醇类和氨基酸类化合物作为发酵虫草菌粉主要化学成分和药效物质基础,却没有进行系统性的质量控制,导致现有的质量标准并不能够完全反映发酵虫草菌粉的质量,其产品批间一致性尚未完全开展。课题组前期已经完成了发酵虫草菌粉多糖和核苷类化合物的质量控制,为进一步提升发酵虫草菌粉的质量控制标准,对其产品展开批间一致性评价研究,本课题采用指纹图谱结合一测多评的质量控制模式对发酵虫草菌粉甾醇类化合物进行质量控制研究;建立发酵虫草菌粉氨基酸指纹图谱,并对发酵虫草菌粉氨基酸含量测定方法进行比较研究;探索发酵虫草菌粉太赫兹光谱吸收,通过太赫兹时域光谱、频域光谱和吸收系数曲线谱区别不同发酵虫草菌粉类产品,并评价其质量。以期为发酵虫草菌粉质量控制和批间一致性评价研究提供一定的实验依据。1.发酵虫草菌粉甾醇化合物指纹图谱研究以金水宝胶囊、金水宝片、百令胶囊为样品,采用基于高效液相色谱的指纹图谱、相似度分析、主成分分析及聚类分析对发酵虫草菌粉类甾醇类化合物进行定性分析。结果表明:金水宝胶囊、金水宝片、百令胶囊产品批次间相似度均大于0.9,具有较高的一致性、稳定性,三种产品的批间一致性较好;金水宝胶囊和金水宝片指认了4种甾醇物质,分别为胡萝卜苷、麦角甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇,百令胶囊仅含有麦角甾醇和豆甾醇;主成分分析和聚类分析结果显示同一菌种、同一厂家生产的金水宝胶囊及金水宝片被归为一类,百令胶囊另外被归为一类,这与实际情况相符。2.一测多评法应用于发酵虫草菌粉甾醇含量测定以麦角甾醇作为内标物,利用QAMS法对胡萝卜苷、豆甾醇和β-谷甾醇进行定量分析,考察了仪器、流速、色谱柱类型等因素对相对校正因子(RCF)的影响,并将QAMS法测得各目标物的含量与外标法测得各目标物的含量进行比较,结果表明,RCF在不同的仪器、流速、色谱柱类型条件下RSD均小于5%;QAMS法测得的结果与外标法测得的结果相对误差均小于±5%,显示两组数据间无显著性差异,表明QAMS法可作为一种高效便捷的方法对发酵虫草菌粉类产品中的甾醇类物质进行同时测定。3.发酵虫草菌粉氨基酸指纹图谱研究采用高效液相色谱,建立发酵虫草菌粉类产品氨基酸指纹图谱,结合相似度分析、主成分分析及聚类分析对发酵虫草菌粉氨基酸进行定性分析。结果表明,金水宝胶囊、金水宝片、百令胶囊产品批次间相似度均大于0.9,具有较高的一致性、稳定性,三种产品的批间一致性较好;三种产品均确定了20个共有峰,其中1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13,14,16,17,19,20号色谱峰被指认为门冬氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸。主成分分析结果显示同一菌种、同一厂家生产的金水宝胶囊及金水宝片被归为一类,百令胶囊另外被归为一类。聚类分析结果显示样品共分为三大类,金水宝胶囊聚为一类,金水宝片聚为一类,百令胶囊聚为一类;将金水宝胶囊和百令胶囊进行聚类分析,结果显示样品被聚为两大类,金水宝胶囊聚为一类,百令胶囊聚为一类,与实际情况相符。4.发酵虫草菌粉氨基酸含量测定比较研究分别采用柱前衍生(RP-HPLC)法和柱后衍生(AAA)法对发酵虫草菌粉氨基酸进行含量测定,并对两种方法测定的氨基酸含量测定结果进行比较分析,结果显示两种含量测定方法结果较为接近,丙氨酸、组氨酸和甲硫氨酸含量测定存在一定的差异。以甘氨酸作为内标物,利用QAMS法对16种氨基酸进行定量分析,考察了仪器、流速、柱温、不同仪器及色谱柱类型等因素对相对校正因子(RCF)的影响,并将QAMS法测得各目标物的含量与外标法测得各目标物的含量进行比较,结果表明,RCF在不同的仪器、流速、柱温、不同仪器及色谱柱类型条件下RSD均小于5%;t检验结果显示QAMS法测得的结果与外标法测定结果P值均大于0.05,显示两组数据间无显著性差异,表明QAMS法可作为一种高效便捷的方法对发酵虫草菌粉类产品中的16种氨基酸类物质进行同时测定。5.发酵虫草菌粉太赫兹波光谱研究使用太赫兹光谱技术,分别测量发酵虫草菌粉类产品金水宝胶囊和百令胶囊的太赫兹时域光谱信息,经过傅里叶转换得到频域谱、折射率谱和吸收曲线谱,通过四种光谱信息结合主成分分析评价发酵虫草菌粉产品的质量。结果显示,金水宝胶囊和百令胶囊在太赫兹折射率曲线谱没有明显的差异,太赫兹时域谱、频域谱和吸收系数曲线谱上均存在一定的差异,通过三种谱线可以明显区分两种产品。将所有样品的吸收曲线谱经过元散射矫正(multiplicative signal correction,MSC)、特殊点基线法(baseline)和标准正态变量(standard normal variate,SNV)处理后进行主成分分析。结果显示金水宝胶囊聚为一类,且聚类效果较好,百令胶囊聚为一类,聚类结果在一定程度上反映批间的一致性。