背景：　　超声波既可以用于人体疾病的诊断，又可作为一种能量形式用于疾病的治疗。超声造影剂是一种由气体填充，脂质体或蛋白质包裹的微泡（一般直径在1-10μm）。微泡能有效地增强心肌、肝、肾、脑等实质器官的二维灰阶和多普勒血流信号，可监测器官内的血流灌注情况，明显提高超声诊断的敏感性和特异性，已在临床得到广泛应用。诊断超声（2.3MHz，MI值为0.4）联合微泡对细胞也有一定的损伤作用，会引起红细胞外渗以及细胞死亡。这个结果明确显示了诊断超声联合微泡的生物效应，虽然对活体的参数设定不是很明确。超声联合微泡的治疗虽然仍处于实验研究阶段，但其临床应用潜力巨大，是近几年超声医学研究的热点。微泡经静脉注入血管后，由于微泡直径的限制，难以渗透到组织间隙，其治疗效应主要作用于血管壁。超声联合微泡对正常微小血管的损伤作用主要表现为内皮细胞的形态改变、坏死和脱落，基底膜断裂和小动静脉内血栓形成等。超声联合微泡技术已用于基因治疗、溶栓治疗、药物输送、肿瘤物理治疗、创伤止血、干细胞移植等方面的实验研究。　　超声联合微泡既可以断开细胞间紧密的连接，也可以增加物质的跨细胞运输，空化效应是其主要机制。在不同条件下，其对血管的损伤程度不同，频率为1MHz，声压为0.8MPa时会产生血管炎症，而声压为2.0MPa时则有明显的血管内皮损伤。在超声的作用下，微泡振荡产生的微流、周期性的收缩与膨胀产生的作用力以及微泡破裂产生的微射流作用可对附近的血管壁产生轻微损伤,这种损伤在一定程度上增加了血管的通透性。超声生物学效应可改变细胞膜通透性，有利于药物/基因的跨胞膜递送。　　超声联合微泡在基因治疗方面的研究发展迅速，主要应用于皮肤、心脏、胰腺、肾脏、骨骼肌以及肿瘤组织。基因转染或药物传输的最佳条件是能最大限度地增加细胞膜通透性，又不造成细胞膜的不可逆损伤，且超声辐照携带基因或载药微泡，广州医科大学硕士学位论文　　可靶向特异组织释放出基因或药物。低频超声可增强药物的经皮渗透，主要机制是超声作用于皮肤间的本身存在的空泡，产生空化效应，使细胞间产生空隙，皮肤上皮层分散，从而使小分子药物通过。　　超声联合微泡对血管可以产生严重或不可逆性的损伤作用。血管毁损术(Angiotripsy)是指将微泡造影剂注入静脉，在较低的平均声强下进行超声辐照，对微血管产生一定的损毁作用，而治疗区域没有明显的热效应。微泡经静脉注入血管后，由于微泡直径的限制，难以渗透到组织间隙，损伤作用主要发生在微小血管，超声辐照区域的微血管破坏，使组织局部微循环血供停止而达到治疗的目的。以上述研究为基础，本实验研究在一定治疗参数下对肠壁及肠系膜不同内径血管损伤程度的不同。　　目的：　　超声联合微泡诱发血管损伤在过去几年中被广泛研究，但机制研究较缺乏，多数是在离体细胞水平或者模拟血管，以细胞水平的研究为主。超声联合微泡对细胞产生的声孔效应可在细胞膜上发现小孔并可测量孔径，有研究成功将荧光分子直接通过细胞膜上形成的小孔进入细胞质，而细胞仍可保持生物活性。这几年随着摄像技术的发展，使用高速摄像显微镜观察单个微泡空化效应对内皮细胞膜的损伤，从而研究超声激励的微泡对细胞的作用机制，研究着重在稳态空化的作用，对于血管造成的是轻微的可逆的损伤作用。虽然先前研究结果显示，超声联合微泡对血管的严重损伤在肿瘤治疗、实质脏器的创伤止血等方面具有较好的应用前景，但没有实时观察对在体血管的损伤过程，对血管损伤的机制方面也缺乏研究。本文主要研究超声联合微泡在体肠壁上的毛细血管及肠系膜动静脉微血管的损伤作用，并且对血管损伤程度进行分类，更直观的观察低频高负值峰压超声诱导微泡对在体微血管的直接损伤作用。　　方法：　　健康新西兰大白兔20只，质量约2.0-2.5kg。所有实验大白兔术前禁食12h，可自由饮水。将其中2只大白兔设为空白组，余18只设为实验组。实验用新西兰大白兔先使用速眠新Ⅱ注射液（由吉林省敦化市圣达动物药品有限公司生产）0.2ml/kg进行肌肉注射，等待兔子初步麻醉后，使用21G针管插入实验兔左耳的耳缘静脉建立静脉通道，使用2.5％戊巴比妥钠（1.0ml/kg）麻醉。　　室温保持恒定，湿度在40-60%之间，并且维持动物在深度麻醉下进行实验，实验兔仰卧位固定后，中下腹备皮，沿腹白线开腹，将部分小肠拉出体外，兔子侧卧位摆放，选择一段肠系膜血管进入肠壁分支较多的肠管（大约5cm）固定，肠管内注入脱气水（水域温度37℃），使用显微镜（Olympus IX71倒置荧光显微镜——日本Olmpus公司）观察治疗前血管形态，记录并将中心区域观察血管做标记；然后将固定肠管放入注满脱气水的容器中。抽取脂氟显微泡悬液0.2ml/kg，加入生理盐水稀释至4ml，5min内经静脉通道缓慢匀速注入。实验组同时用超声治疗仪辐照之前观察并标记的肠壁及肠系膜血管区域5 min，空白组假照目标肠壁及肠系膜5min。治疗结束后，使用显微镜再次观察标记血管，并记录。然后经耳缘静脉注入伊文思蓝溶液（2%）5ml，观察伊文思蓝在目标血管内的灌注情况，并记录。　　血管分级：肠壁血管肉眼下可见，由于治疗后，肠壁透光变差，且部分血管变形，内径测量不准确，所以在治疗前使用显微镜放大40倍观察血管，可以明确观察到肠系膜血管进入肠壁后每一级血管，并将血管分级。第一级：内径>100μm的血管，这级血管包含肠系膜血管，以及部分肠壁血管；第二级内径60-100μm的血管；第三级30-60μm；第四级10-30μm，这级血管为微小动、静脉血管；第五级为<10μm的毛细血管网。在治疗后再次用显微镜观察治疗区域，并统计出不同级别的动静脉血管的损伤程度的不同。由于在显微镜视野下毛细血管呈网状分布，难以计数，未计入统计学分析，故仅观察超声作用下毛细血管的形态学改变。　　损伤程度分级：损伤照程度由低到高分为四级，第一级血管周围未见渗出，即在治疗后血管未观察到明显的变化以及渗出；第二级血管周围可见少量渗出，未形成血肿，在伊文思蓝灌注后血管边界模糊；第三级为血管周围可见大量渗出并形成血肿；第四级是血管血流阻断，即在静脉注入伊文思蓝后血管血流阻断，远端血管未见伊文思蓝灌注，或者毛细血管可见红蓝分界。　　病理学检查：实验结束后，使用戊巴比妥钠(2.5%)10ml/kg静脉推注进行过量麻醉安乐死，立即切取治疗中心的肠壁组织，置于10%福尔马林溶液固定1d，经脱水、石蜡包埋及苏木素伊兰（HE）染色等程序后，连续切片制成病理切面，显微镜下进行病理学观察。　　统计学方法：实验组共18只兔，每只兔均对治疗区域内的一至四级血管进行统计分析，第五级血管（毛细血管）因计数困难而仅对损伤程度进行描述。一、二级广州医科大学硕士学位论文　　血管均记录3条动脉和3条静脉血管，根据血管内径的不同，1-2级血管每级动、静脉血管数量各54条。第三级血管（30-60微米）在视野下可观察到清晰的分叉，动静脉血管各62支，第四级血管在视野下由第三级血管主干分叉出，血管清晰，长度大于100微米，符合第四级血管（10-30微米）要求的血管计数为96支动脉及102支静脉。各组别之间损伤程度的比较采用卡方检验，以P<0.05有统计学意义。统计分析采用SPSS13.0软件。　　结果：　　统计学结果:　　不同组动/静脉血管两两比较：　　01组>100μm VS60-100μm、02组>100μm VS30-60μm、03组>100μm VS10-30μm、04组60-100μm VS30-60μm、05组60-100μm VS10-30μm、06组30-60μm VS10-30μm　　以上6组所得P值均小于0.05，说明两两之间在血管损伤中的频数分布不同。第1-4级血管类型中：阻断的发生率最高的是第四级（10-30μm）动/静脉血管。大量渗出的发生率最高的是第三级（30-60μm）动/静脉血管；少量渗出的发生率最高的是第二级（60-100μm）动/静脉血管；未见明显损伤的发生率最高的是第一级（>100μm）的动/静脉血管。　　第五级血管毛细血管，在显微镜下放大100倍下观察，取毛细血管显示清晰且较均匀分布而少大血管的区域，一个视野内的毛细血管分布区域分为36×48个小格，观察其中渗出所占格数，得到毛细血管渗出面积为（4.3±1.7）%。在显微镜下放大200倍观察毛细血管管壁较薄，可观察到部分毛细血管内红细胞的流动，在注入伊文思蓝后，多个被阻断的毛细血管出现明显的红蓝交界。　　血管形态改变：治疗后可见血管发生明显的变形。有的血管内径发生变化，部分动脉血管内径比治疗前增宽；部分动脉血管管壁呈波浪状改变；有的血管走行较治疗前有改变，表现为血管分叉处夹角增大，多出现在第二、三、四级血管。　　在病理切片中，空白组各级血管管壁平整，血管周围未见红细胞渗出，部分血管内可见少量红细胞堆积，肠壁组织结构规则，内未见红细胞溢出。治疗组微动静脉血管对比空白组可见明显扩张，以静脉血管为主，扩张血管内可见大量红细胞堆积，以血管分叉处为主；部分微动静脉血管内可见不典型性血栓，呈长条状，贯通血管；部分血管周围可见红细胞溢出，血管壁内皮细胞可见少量脱落。周围组织肠黏膜、肠黏膜下以及肌层内红细胞堆积较明显，腺体间隙偶可见微小动静脉末端以及毛细血管。　　结论：　　1、超声联合微泡可以对肠系膜及肠壁各类型血管产生不同的损伤作用。　　2、本实验的治疗参数下，可观察到阻断的最大血管内径为38μm，为微动脉血管。　　3、一至四级血管中，阻断发生率最高的是第四级（10-30μm）动/静脉血管。大量渗出发生率最高的是第三级（30-60μm）动/静脉血管；少量渗出发生率最高的是第二级（60-100μm）动/静脉血管；未见明显损伤发生率最高的是第一级（>100μm）的动/静脉血管。　　4、第五级毛细血管治疗后出现血流阻断、渗出及血流速度减缓。