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PI3K-Akt-mTOR信号通路作为细胞内重要的信号传导通路，参与调控了包括细胞周期、存活、代谢、运动及增殖在内的众多细胞功能。由于该信号通路在信号网络中所处的核心地位，同肿瘤的形成和恶化过程密切相关，因此靶向PI3K信号通路已成为抗肿瘤药物研究和开发的热门靶点，已有多个候选药物用于临床肿瘤治疗或进入临床阶段研究。随着对PI3K-Akt-mTOR信号通路及其抑制剂研究的深入，其信号网络的复杂性和正负调控途径逐渐为人们所了解，这可能是PI3K信号通路小分子抑制剂抗肿瘤效果较为温和、易出现药物耐受的原因之一。本课题旨在通过建立PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制剂的联合用药筛选平台，寻找具有协同抗肿瘤作用的用药组合并探寻其协同机制，从而有助于提高该类抑制剂的抗肿瘤疗效，克服药物耐受并扩大其应用范围。 筛选具有协同抗肿瘤效应的药物联用组合有赖于有效评价平台的建立。我们以两药联合的给药形式作用于肿瘤细胞，用磺酰罗丹明B法检测化合物单用及联用时对肿瘤细胞增殖抑制效应。针对抗肿瘤药物的不同药效动力学特性，分别采用相对效应法和基于Chou-Talalay方法的软件Calcusyn计算出联用系数CI从而筛选出具有协同抗肿瘤效应的联合用药组合。肺癌和结直肠癌是人群中的高发肿瘤类型，但是目前临床上缺乏有效药物，同时在这两类肿瘤中PDK信号通路以高频率异常活化。因此我们选取非小细胞肺癌细胞A549、H460和结直肠癌细胞HCT116、HT29作为研究对象，利用建立的联合用药筛选平台对不同作用机制且已应用于临床的18个代表性小分子药物，与四种PI3K信号通路抑制剂包括mTORC1抑制剂雷帕霉素、新型PI3Kα抑制剂CHY33、mTOR激酶抑制剂AZD8055和PI3K/mTOR双重抑制剂BEZ235之间的联用进行了评价，得到了多个联用系数小于0.8的用药组合，表明这些用药组合具有良好的协同抗肿瘤效应。由于肺癌的新增病例和死亡人数居位居全世界各肿瘤类型的首位，其中非小细胞肺癌占临床病例的80％多。因此我们选定在肺癌细胞中，对具有代表性的两组用药组合——mTORC1抑制剂雷帕霉素与酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼联用以及新型PI3K亚型选择性抑制剂CHY33与CDK4/6抑制剂PD0332991联用的协同抗肿瘤效应机制进行了深入研究，以期为基于PI3K信号通路抑制剂的联用治疗肺癌提供线索和依据。 雷帕霉素与舒尼替尼联用能够对A549和H460非小细胞肺癌细胞产生显著的协同抗肿瘤效应，其三次重复实验的平均联用系数CI分别为0.61和0.52。与舒尼替尼单用比较，联合用药后对A549细胞增殖的半数抑制浓度IC50从9.93±1.46μM降低至5.87±1.18μM，而对H460细胞的IC50从9.30±2.77μM降低至4.93±1.89μM。舒尼替尼能够抑制雷帕霉素引起的Akt负反馈激活，同时增强对mTOR下游主要底物p70S6K1和4E-BP1磷酸化的抑制，从而增强雷帕霉素引起的G1期阻滞。此外，舒尼替尼与雷帕霉素联合作用还具有协同抑制肿瘤血管新生效应，能够更有效地抑制人脐带静脉上皮细胞的管腔形成、大鼠动脉环微血管的出芽以及鸡胚尿囊膜的血管新生，该效应依赖于联用对肿瘤细胞VEGF的分泌以及HIF1α表达的增强抑制效应。 PI3K/mTOR信号通路是K-ras下游重要的信号转导通路，因此靶向PI3K/mTOR信号通路为K-ras激活的肺癌治疗提供了可行途径。CYH33是我们实验室前期发现的一种PI3K亚型选择性抑制剂，特异性靶向ClassⅠA家族P110α的催化亚基。在包括K-ras突变在内的11株不同基因背景非小细胞肺癌细胞中的增殖抑制实验结果显示，对CYH33的敏感性存在显著差异，其中CYH33对H23、H441、H522、H226、H1650和H596细胞的半数增殖抑制浓度IC50均大于10μM，表现为药物耐受;而A549（IC50=1.80±0.81μM）、H460(IC50=0.65±0.19μM)、H358(IC50=1.42±1.22μM)、H197(IC50=0.15±0.07μM)和Calu-3（IC50=0.59±0.38μM）则对CHY33较为敏感。为探寻K-ras突变NSCLC细胞细胞对CYH33耐受机制，我们在5株K-ras突变NSCLC细胞中进行了深入研究。我们发现与敏感细胞相比，耐受细胞在CYH33作用下其4E-BP1磷酸化水平降低不明显，cyclinD蛋白的表达及其下游主要底物Rb的磷酸化受到的抑制效应也较弱。联合用药筛选结果显示在A549和H460细胞中CYH33与PD0332991联用具有协同抗肿瘤效应，其联用系数分别为0.17和0.11，提示CYH33与PD0332991联用可能增强其抗肿瘤效应克服药物耐受。联用CYH33和PD0332991在敏感和耐受细胞中均显示出显著的协同抑制肿瘤增殖效应。PD0332991通过靶向CDK4/6-cynlinD复合物从而加强了对G1期主要调控蛋白Rb磷酸化的抑制，导致G1期阻滞效应的增强。此外，CYH33和PD0332991联用增强诱导肿瘤细胞凋亡。 综上所述，我们构建了联合用药细胞水平筛选平台，运用该平台开展了基于PI3K信号通路抑制剂的联合抗肿瘤系统筛选，得到多组新颖的且具有良好协同抗肿瘤效应的用药组合，并系统深入地探寻了其协同抗肿瘤机制。雷帕霉素与舒尼替尼联用协同抗肿瘤和抑制肿瘤血管新生机制的揭示，为提高以mTOR为靶点的抗肿瘤药物疗效提供了重要依据，丰富了雷帕霉素及其类似物的联用抗肿瘤治疗的研究。CYH33和PD0332991联用在肺癌细胞中展现的显著抗肿瘤效应则进一步证明了联合用药筛选平台的有效性和可靠性，并为克服PI3K信号通路抑制在肺癌治疗面临的药物耐受现象，扩大其应用范围提供了新的途径。