过量饮酒对健康造成极大损害,并引发众多不良社会后果,每年造成约250万人死亡,更为可怕的是越来越多的年轻人受到影响。世界卫生组织发表的《酒精与健康全球状况报告》中指出,酒精是世界上第三大导致疾病的危险因素。国内外研究表明大量饮酒可通过多种途径促进脑血管意外的发生,但其具体机制尚未明了。在法医学实践中,大量饮酒后轻度外力作用导致蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage SAH)的案件较为常见,大量饮酒对脑血管的损伤以及饮酒在此类案件中的参与度问题成为法医学、临床医学及基础医学的研究焦点。CD146为黑色素瘤粘附分子,在所有人血管内皮细胞上成阳性表达,为血管内皮粘附分子。目的:本实验目的是在建立大鼠饮酒模型的基础上,采用顶空气相色谱仪检测大剂量饮酒后血乙醇浓度(blood alcohol content BAC)的变化情况;应用自动凝血分析检测仪测定饮酒不同时间大鼠凝血功能系列指标,观察分析各指标变化的内在联系;通过HE染色、免疫组织化学染色以及透射电子显微镜(transmission electron microscope TEM)技术与方法,深入观察饮酒大鼠脑血管内皮细胞及其细胞间连接的改变,观察CD146在脑血管内皮细胞的表达情况,探讨其在大量饮酒后内皮细胞连接改变中的作用,进一步阐明大量饮酒对脑血管的影响及作用机制,为饮酒后轻度外力作用导致SAH案件的饮酒参与度鉴定提供理论基础。方法:健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重220g±10g,用市售白酒北京红星二锅头(56%v/v)制备模型,采用大鼠灌胃器进行灌胃,实验前均给予适应性蒸馏水灌胃1周。1不同时间BAC测定:取6只220g±10g雄性SD大鼠,以56%v/v 1.2mL/100g给予白酒灌胃一次,分别于灌胃后0.5h、1h、2h、3h、6h、12h共6个时间点,由内眦眶内静脉丛取血,左右眼轮换,每次每只取血约200-300μl,密封。应用顶空气相色谱仪检测各时间点BAC,确定该剂量白酒灌胃后BAC峰值的出现时间。2将60只雄性SD大鼠随机分成正常对照组、饮酒1次组、饮酒7天组、饮酒14天组、饮酒21天组、饮酒28天组。饮酒各组以56%v/v 1.2mL/100g/次的灌酒量进行灌胃。除饮酒1次组,其他各饮酒组每天白酒灌胃2次,间隔10小时。正常对照组用等体积蒸馏水代替白酒进行灌胃。在此期间观察大鼠的行为学改变,测量并记录大鼠体重变化情况,记录存活情况。各组末次灌胃后抽取心血,断头取脑组织、肝脏组织。取血后全自动凝血分析仪检测凝血酶原时间(prothrombin time PT)、凝血酶时间(thrombin time TT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplatin time APTT)及纤维蛋白原(fibrinogen FBG)。肝组织制备石蜡切片,进行HE染色观察;全脑固定制作石蜡切片,应用免疫组织化学方法观察大鼠脑血管CD146蛋白的表达变化;应用TEM观察大鼠基底动脉及大脑中动脉的病理损伤情况。数据采用均数士标准差(Mean士SD)表示,用SPSS 16.0统计分析软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),用最小显著差法(LSD)作两两比较,以P<0.05为有显著性差异。结果:1大鼠行为学改变,体重变化:大鼠白酒灌胃操作较蒸馏水灌胃困难。大鼠饮酒后短时间内出现不同程度的兴奋性增加的表现,20min后逐渐出现昏睡,翻正反射消失等急性酒精中毒临床表现。随着后期实验时间延长,饮酒组进食量减少,灌胃时抵抗反应减轻,饮酒后未见明显兴奋性增强表现,活动性减弱,反应迟钝,给予灌酒14天后个别大鼠出现肢体偏瘫。体重增长缓慢,21天组和28天组大鼠体重与对照组相比增长明显减少(21天组P<0.05,28天组P<0.01)。2 BAC:按照56%v/v 1.2mL/100g剂量给予大鼠一次性灌酒,BAC在0.5小时为190.29±29.34mg/dl,至1小时浓度达到峰值,为225.06±43.10mg/dl,2小时BAC为194.08±32.30mg/dl,之后浓度逐渐下降,至12h为25.37±18.21mg/dl。说明大鼠饮酒后约1-2h乙醇吸收达高峰。3凝血功能指标检测:各组末次灌胃后2小时采取血浆。饮酒14天组TT明显缩短,与其他各组均有显著差异(P<0.05);饮酒14天组PT延长,与其他各组均有显著差异(P<0.05);饮酒各组APTT与正常对照组没有明显差异;饮酒7天组FBG延长,与其他各组有显著差异(P<0.05)。4组织病理学改变:4.1肝脏病理学改变:对照组可见肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列,细胞形态规整,肝小叶结构清晰;饮酒1次组可见肝细胞水肿伴部分肝细胞轻度脂肪变性,随着饮酒时间的增加可见肝细胞脂肪变性的加重,炎细胞聚集,进而又出现多发片状坏死。4.2 CD146免疫组织化学结果:正常对照组以及饮酒各组脑实质微血管、静脉、蛛网膜下腔血管和基底动脉血管壁均有CD146阳性表达,其中动脉血管壁主要在平滑肌层表达,静脉及微血管在内皮细胞表达明显。其中对照组表达为(+),1次灌酒组所有类型血管中阳性表达为弱阳性(±),7天组、14天组、21天组各类血管阳性表达逐渐加强(++~++++),28天组阳性表达明显减弱(±)。在各实验组中,脑实质毛细血管及微小血管阳性表达的变化较基底动脉、大脑中动脉及其他小动脉明显。4.3脑基底动脉、脑中动脉超微结构改变:实验7天组内皮细胞间连接开始出现小阶段融合,实验14天组至28天组内皮细胞损伤逐渐加重,出现内皮细胞形态不规则,内皮细胞细胞间质可见圆形大空泡,新生吞饮小泡增多,粗面内质网脱颗粒现象。表面微绒毛卷曲,微绒毛凸起减少,细胞间紧密连接融合部分逐渐增加,模糊不清。各组基底动脉内皮细胞的改变与大脑中动脉的内皮细胞变化未见明显不同。结论:1饮酒不同时期处死大鼠(处死时间均在饮酒后2小时),检测结果表明大鼠凝血功能出现异常。2长期大量饮酒引起大鼠脑血管内皮粘附分子CD146的表达变化,并对血管内皮连接造成不同程度的损伤,影响脑血管的通透性,增加了饮酒后外伤性蛛网膜下腔出血的危险性。