背景与目的世界范围内,肺癌是恶性肿瘤致死的首要病因。在我国,肺癌发病率与死亡率也居高不下,并有逐年增高的趋势。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌最常见的病理类型,约占85%,其5年生存率不足20%。超过55%的中国NSCLC患者都有表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因的异常活化突变,如19外显子缺失突变和21外显子L858R突变,这部分患者对酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs),如厄洛替尼和吉非替尼,有较好的反应性。因此,分子靶向治疗已成为EGFR敏感突变的晚期NSCLC患者的首选一线方治疗方案,明显延长了患者的无进展生存期(progress-free survival,PFS)并改善了患者的生存质量。然而,尽管EGFR-TKIs疗效显著,但患者在用药12个月左右通常不可避免会出现TKIs继发耐药,出现肿瘤复发或者疾病进展。因此,NSCLC EGFR-TKIs继发耐药已成为一个亟待解决的问题。NSCLC EGFR-TKIs继发耐药的原因多种多样,常见的有EGFR T790M突变、MET基因扩增、HGF过表达以及PTEN的低表达等。课题组在前期的研究中也发现了PTEN在厄洛替尼继发耐药的NSCLC细胞中低表达的现象。PTEN(gene of phosphate and tension deleted on chromsome ten)是迄今发现的第二大肿瘤抑癌基因,中文名为人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因,位于10q23,转录产物为515kb m RNA。其编码的PTEN蛋白在PI3K/AKT信号通路的中间环节负性调节其活性,继而影响细胞多种生物学功能。现有证据表明,PTEN表达降低与肿瘤TKIs耐药相关,且EGFR-TKIs继发耐药患者的临床标本中也发现了PTEN的下调。随着对PTEN调节机制研究的深入,有学者发现,NEDD4(Neuralprecursor cell expressed developmentally down-regulated 4,也被称为NEDD4-1)作为一种E3泛素链接酶,在细胞中能有效促进PTEN与泛素蛋白结合,从而导致PTEN多泛素化降解,在负性调节PTEN蛋白表达的过程中发挥着重要作用。多组数据证实,NEDD4介导的PTEN泛素化降解与肿瘤的发生发展均有着密切的关系。且在多种肿瘤组织中两者都存在着此消彼长的关系。但这一过程与NSCLC EGFR-TKIs继发耐药是否相关还鲜见报道。本课题以EGFR 19外显子缺失突变的肺腺癌HCC827细胞和厄洛替尼诱导耐药的HCC827/ER细胞为研究对象,对NEDD4介导的PTEN泛素化降解在NSCLC厄洛替尼继发耐药中的作用及相关机制做一探讨,以期为NSCLC EGFR-TKIs继发耐药机制的研究打开新的思路,并为克服其耐药提供新的靶点。研究方法1、观察HCC827及HCC827/ER细胞的生长情况,用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测并比较两种细胞对厄洛替尼的敏感性。2、利用q RT-PCR、Western blot等方法检测并比较HCC827和HCC827/ER细胞中中NEDD4、PTEN的m RNA和蛋白的表达差异;蛋白酶体抑制剂MG132处理HCC827/ER细胞后,观察细胞中PTEN蛋白的变化情况。3、以HCC827/ER细胞为研究对象,以装载si NEDD4的慢病毒载体,构建稳定的NEDD4敲低的HCC827/ER细胞。q RT-PCR检测慢病毒感染前后NEDD4和PTEN的表达变化;Western blot检测NEDD4、PTEN及其下游信号分子的表达变化。以CCK-8法检测NEDD4敲低后HCC827/ER细胞对厄洛替尼的耐药指数变化。4、以HCC827、HCC827/ER、HCC827/ER-EV和HCC827/ER-si NEDD4四种细胞为模本,建立裸鼠移植瘤模型,体内实验验证NEDD4在NSCLC厄洛替尼继发耐药中的作用。研究结果:1、CCK-8法检测HCC827和HCC827/ER细胞对厄洛替尼的敏感性,提示厄洛替尼对HCC827细胞的半数抑制浓度(50%inhibition concentration,IC50)值为(0.10±0.12)μM,其对HCC827/ER细胞的IC50值为(11.6±0.90)μM。HCC827/ER细胞的耐药指数为118.23±23.77。与HCC827细胞相比,HCC827/ER细胞中NEDD4的在m RNA和蛋白水平均有明显升高,PTEN的m RNA和蛋白表达均有降低,但蛋白降低的更为明显,p-AKT的表达明显升高。MG132处理HCC827/ER细胞后,其PTEN的表达有明升高。2、敲低HCC827/ER细胞中NEDD4的表达后,与空白对照组相比,NEDD4敲低组细胞中NEDD4 m RNA和蛋白均有明显降低,PTEN m RNA基本没有变化,但PTEN蛋白的表达升高,p-AKT的表达也明显降低。对比两者对厄洛替尼的敏感性,厄洛替尼对空白对照组的IC50值为(13.88±1.96)μM(P<0.05),对NEDD4敲低组的IC50值则有明显下降,为(0.72±0.12)μM(P<0.05)。3、裸鼠移植瘤实验中,经相同浓度厄洛替尼处理后,HCC827组肿瘤增长较HCC827/ER组受到明显抑制,HCC827/ER-si NEDD4组对厄洛替尼的敏感性也明显优于HCC827/ER-EV组。研究结论:1、NEDD4的高表达在NSCLC厄洛替尼继发耐药中发挥重要作用。2、PTEN泛素化降解在NEDD4促进NSCLC厄洛替尼继发耐药中发挥着重要作用。3、NEDD4敲低可部分恢复PTEN蛋白的表达水平,并增加耐药细胞对厄洛替尼的敏感性。4、裸鼠移植瘤实验显示,NEDD4敲低能够改善NSCLC荷瘤小鼠对厄洛替尼继发耐药,在活体水平证实NEDD4促进NSCLC厄洛替尼继发耐药。