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研究目的:胃癌（Gastric Cancer,GC）是常见消化系统肿瘤之一,虽己证实幽门螺旋杆菌（Helicobacterpylori,Hp）的持续感染是其发生发展的重要因素,但胃癌发生发展过程涉及到多种因素,且存在个体遗传差异。深化探索胃癌的潜在发病机制,并寻找新型诊断标志物与潜在治疗靶点对控制胃癌的发生及进展至关重要。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一种不具有3’端、5’端及polyA尾的单链闭合环状非编码RNA。circRNA的封闭式环状结构导致其不易被核酸外切酶分解,因此比线性RNA更稳定。circRNA在不同物种中具有进化保守性,并且通常在不同组织及不同发育阶段具有表达特异性。多个circRNA已被证实在肿瘤的发生发展过程中起关键作用,可作为新型肿瘤标志物。circRNA功能丰富,可与RNA结合蛋白相互作用,作为miRNA海绵调节靶基因表达,参与基因的转录后调节,部分circRNA具有翻译功能。虽然已有’些研究探讨circRNA对胃癌的作用,但是多数停留在表达水平,对其作用机制仍未明确。本研究首先选用circRNA芯片进行胃癌组织与癌旁组织表达谱分析,寻找差异表达的circRNA,并探究其在胃癌中的作用及机制,拟发掘胃癌的潜在标志物,探索胃癌发生发展的分子机制以期为胃癌的分子靶向治疗提供新方向。研究方法:利用circRNA芯片筛查10对胃癌组织及相应癌旁组织差异表达的circRNAs,并在胃癌组织和癌旁组织中进行qRT-PCR实验验证表达最高的8个circRNAs,根据验证的结果进一步筛选circRNAs,在胃癌BGC-823细胞中使用siRNA分别下调备选circRNA后使用CCK8实验检测细胞增殖率,Transwell小室检测细胞侵袭能力。细胞功能影响最明显的circRNA作为目标circRNA。利用慢病毒构建稳定转染circCACTIN过表达MGC-803细胞模型后,CCK8实验检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力,明确circCACTIN在胃癌细胞恶性生物学行为中的作用。在RNA Interactome中预测circCACTIN的靶点:hsa-miR-1205、hsa-miR-1225-3p、hsa-miR-1233、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-661。qRT-PCR检测在circCACTIN下调的BGC-823细胞中5个miRNA的表达水平改变。双荧光素酶报告基因验证circCACTIN与miR-331-3p的结合位点。运用转染技术改变胃癌细胞circCACTIN和miR-331-3p的表达水平,通过细胞功能学实验明确circCACTIN与miR-331-3p之间的调节关系。此外,从Targetscan网站中预测的miR-331-3p靶点中挑选8个与迁移与侵袭相关的基因,包括:SEMA7A,RCC2,TGFBR1,MEIS1,ITGA9,SYT7,FZD4,MSI1。通过 qRT-PCR 检测 miR-331-3p过表达的BGC-823细胞中8个mRNA的表达变化。双荧光素酶报告实验、细胞功能学实验、Western Blot实验分析miR-331-3p对于TGFBR1的靶向作用,探讨circCACTIN在胃癌细胞中可能的作用机制。最后通过裸鼠成瘤实验证实circCACTIN在体内对胃癌的作用。结果:1.circRNA芯片检测胃癌组织与癌旁组织共发现1417种差异表达的circRNA（FC≥1.5,P<0.05）,包括外显子型1230种,内含子型82种,正义重叠型72种,反义型27种,基因间型6种。656种circRNA在胃癌组织中表达上调;761种circRNA在胃癌组织中表达下调。根据qRT-PCR验证结果及下调circRNA检测BGC-823细胞增殖和侵袭能力,circCACTIN（hsacirc0092303）被选为研究目标。2.circCACTIN在胃癌组织和胃癌细胞株中表达均上调。CCK8实验显示,与对照组相比,circCACTIN下调的BGC-823细胞增殖率降低,差异有统计学意义（P<0.05）;circCACTIN过表达的MGC-803细胞增殖率无明显改变,差异无统计学意义（P>0.05）。Transwell实验和划痕实验表明:circCACTIN下调的BGC-823细胞迁移能力及侵袭能力明显下降;circCACTIN过表达组MGC-803细胞迁移能力及侵袭能力显著增强。3.在 RNA Interactome 中预测 circCACTIN 的靶点:hsa-miR-1205、hsa-miR-1225-3p、hsa-miR-1233、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-661。qRT-PCR 实验检测在circCACTIN沉默表达的BGC-823细胞中5个miRNA的表达水平改变,结果表明hsa-miR-331-3p表达受circCACTIN的影响最大。双荧光素酶实验表明circCACTIN与miR-331-3p之间存在结合位点。qRT-PCR结果表明,在circCACTIN下调BGC-823细胞中,miR-331-3p表达量显著增高;在circCACTIN上调MGC-803细胞中,miR-331-3p表达量显著降低。下调miR-331-3p后,BGC-823细胞的增殖能力提高;miR-331-3p inhibitor可以逆转circCACTIN下调所致的增殖抑制。过表达miR-331-3p后,MGC-803细胞的增殖能力受到抑制。Transwell实验及划痕实验结果表明:miR-331-3p下调后,BGC-823细胞的侵袭和迁移能力增强;miR-331-3p inhibitor可以逆转circCACTIN下调所致的侵袭和迁移能力减弱;过表达miR-331-3p后,MGC-803细胞的侵袭和迁移受到抑制;miR-331-3p mimic可以逆转circCACTIN上调所致的侵袭和迁移抑制作用。4.qRT-PCR实验检测miR-331-3p过表达的BGC-823细胞中Targetscan预测的8个mRNA的表达变化,结果表明TGFBR1受miR-331-3p的影响最大。双荧光素酶实验表明miR-331-3p与TGFBR1之间存在结合位点。TGFBR1在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。在胃癌细胞中TGFBR1的表达与miR-331-3p的表达呈负相关,与circCACTIN的表达呈正相关。上调TGFBR1后,BGC-823细胞的增殖率提高;Lv-TGFBR1可以逆转circCACTIN下调所致的增殖抑制作用;下调TGFBR1后,MGC-803细胞的增殖能力抑制。Transwell实验及划痕实验结果表明:过表达TGFBR1后,BGC-823细胞的侵袭和迁移能力提高;Lv-TGFBR1可以逆转circCACTIN下调所致的侵袭和迁移抑制作用;下调TGFBR1后,MGC-803细胞的侵袭和迁移受到抑制;si-TGFBR1可以逆转circCACTIN上调所致的侵袭和迁移促进作用。Western Blot结果表明沉默表达circCACTIN可抑制BGC-823细胞的EMT功能,而同时上调TGFBR1可逆转此改变;过表达circCACTIN可促进MGC-803细胞的EMT功能,而同时下调TGFBR1后可逆转此改变。5.在裸鼠成瘤试验中,circCACTIN下调的BGC-823组荷瘤小鼠的肿瘤体积较对照组明显缩小,肿瘤组织质量明显减轻;circCACTIN 上调的MGC-803组荷瘤小鼠的肿瘤体积较对照组增大,肿瘤组织质量增加。免疫组化结果表明circCACTIN 下调组移植瘤细胞EMT水平下降,circCACTIN 上调组移植瘤细胞EMT水平提高。结论:与癌旁组织相比,胃癌组织中有1417种差异表达circRNAs,包括656种上调的circRNAs和761种下调的circRNAs。circCACTIN能够显著促进胃癌细胞的增殖能力、迁移能力、侵袭能力和EMT功能。circCACTIN可与miR-331-3p结合发挥ceRNA作用;TGFBR1在胃癌组织中表达显著上调,可与miR-331-3p靶向结合。circCACTIN通过竞争性结合miR-331-3p间接调节TGFBR1,从而影响胃癌细胞生物学行为,为胃癌发生发展机制提供了新思路。