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蜱传脑炎（Tick-borne encephalitis,TBE）又称森林脑炎,是由蜱传脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus,TBEV）引起的以神经系统病变为主的自然疫源性疾病,可在人与动物中引起致死性脑炎并伴有长期的后遗症,严重威胁人类健康和公共卫生安全。近年来随着全球气候变化,传播病毒的媒介蜱的分布范围不断扩大,蜱传脑炎呈现新的流行特点,表现为旧疫源地重新暴发、流行,新的疫源地不断涌现,并出现了新的病毒亚型。目前,尚没有针对该病的特异性治疗药物,因此,疫苗免疫对于蜱传脑炎的预防控制至关重要。目前已获批的蜱传脑炎病毒疫苗均为灭活疫苗,灭活疫苗具有安全性高的优点,但往往需要多次免疫才能刺激机体产生有效保护,存在成本高、免疫持续期短等缺点。因此,研制安全性高、免疫原性强的新型基因工程疫苗对于蜱传脑炎的防控具有重要意义。基于病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）和细菌样颗粒（Bacterium-like particles,BLPs）研制的新型疫苗不仅具有良好的安全性,且可同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫,是当前疫苗研究是主要方向。本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统分别表达了TBEV-prM-E蛋白和E-PA3融合蛋白,制备TBEV VLPs和TBEV BLPs,通过小鼠免疫实验评价了其安全性和免疫原性,同时基于原核表达的E-DⅢ蛋白建立了TBEV抗体间接ELISA检测方法,为蜱传脑炎新型疫苗的研究奠定基础。具体研究内容包括:（1）蜱传脑炎病毒E蛋白DⅢ的表达与抗体间接ELISA检测方法的建立扩增TBEV E蛋白第三结构域（DomainⅢ,DⅢ）基因并构建重组质粒p ET-30a（+）-TBEV-E-DⅢ。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导目的蛋白表达,利用镍离子金属螯合亲和层析介质（Ni-NTA）纯化目的蛋白。将纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立TBEV抗体间接ELISA检测方法。结果显示,重组蛋白TBEV E-DⅢ在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,蛋白表达的最佳条件为30℃、0.6 mmol/L IPTG诱导6 h。;TBEV抗体间接ELISA检测方法的最佳抗原包被浓度为1 mg/L,该方法可特异性检测TBEV阳性血清,与寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）、日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）和西尼罗病毒（West Nile Virus,WNV）阳性血清无交叉反应,批内和批间变异系数均小于10%。本研究成功表达并纯化了TBEV E-DⅢ重组蛋白,以其为包被抗原建立的TBEV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于检测血清中TBEV特异性抗体。（2）蜱传脑炎病毒病毒样颗粒的制备与实验免疫研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统构建并拯救表达TBEV prM-E基因的重组杆状病毒r BV-prM-E-prM-E,间接免疫荧光、Western Blot和基因组PCR鉴定结果显示,重组杆状病毒r BV-prM-E-prM-E感染Sf9细胞后可成功表达TBEV prM-E蛋白。将重组杆状病毒接种悬浮培养的Sf9细胞,制备TBEV VLPs,通过密度梯度离心对TBEV VLPs进行纯化。将纯化的TBEV VLPs与复合佐剂Poly（I:C）＆Montanide ISA 201VG混合制备疫苗,免疫BALB/c小鼠评价其免疫效果。TBEV VLPs首次免疫后一周在小鼠腹股沟淋巴结细胞中检测到DC细胞和B细胞的活化;三免后一周可在脾脏中检测到T细胞的活化和记忆性T细胞的产生,分泌IFN-γ和IL-4的脾细胞数量显著增多;二免后1周小鼠血清可检测到TBEV特异性IgG产生（1:10）,三免后TBEV IgG抗体水平显著提高,最高可达1:105.5,三免后3个月IgG抗体水平仍能保持1:104.3。综上所述,TBEV VLPs可刺激机体产生细胞免疫和体液免疫;三次免疫可产生免疫记忆,诱导小鼠产生较高且较持久的特异性IgG抗体。（3）蜱传脑炎病毒细菌样颗粒的制备与实验免疫研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统构建并拯救表达TBEV E-PA3融合蛋白的重组杆状病毒r BV-E-PA3-E-PA3。将鉴定正确的重组杆状病毒r BV-E-PA3-E-PA3接种悬浮培养的Sf9细胞进行融合蛋白的表达,取培养液上清与革兰氏阳性增强基质（Gram positive enhancer matrix,GEM）颗粒结合,制备TBEV BLPs。Western blot和透射电镜观察结果显示,TBEV E-PA3融合蛋白成功锚定在GEM颗粒表面。将制备的TBEV BLPs与复合佐剂Poly（I:C）＆Montanide ISA 201VG混合制备疫苗,以肌肉注射的方式免疫BALB/c小鼠,评价其免疫效果。结果显示,首免后1周小鼠血清即可检测到TBEV特异性IgG产生(1:101.7),二免后TBEV IgG抗体水平显著提高,最高可达1:106.9,二免后5个月IgG抗体水平仍保持1:10~6。TBEV BLPs首次免疫小鼠后一周可在腹股沟淋巴结细胞中检测到DC细胞和B细胞的活化;二免后一周可在脾脏中检测到T细胞的活化和记忆性T细胞的产生,分泌IFN-γ和IL-4的脾细胞数量显著增多,脾细胞Th1型细胞因子TNF-α和Th2型细胞因子IL-5、IL-6、IL-10、IL-1β分泌量显著提高。综上所述,TBEV BLPs可刺激机体产生较强的细胞免疫和体液免疫;二次免疫即可产生免疫记忆,诱导小鼠产生高且持久的特异性IgG抗体。本研究制备的TBEV VLPs和TBEV BLPs均可在不同程度上刺激机体产生特异性的细胞免疫和体液免疫,其中TBEV BLPs具有更高更持久的免疫效果,可作为TBEV候选疫苗株。