目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。脑内老年斑(senileplaques,SPs)形成、含有tau蛋白的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NTFs)以及神经元缺失变性是AD的三大病理学特征。AD的发病机理尚不明确,人们提出了诸多假说,但迄今为止没有一种机制能完全解释。近些年来的研究表明脑内的慢性炎症反应是其一重要的病理特征,神经炎症的存在与AD发病的起因发展密切联系,AD发病的炎症机制越来越被大家所重视。磷酸二酯酶4(Phosphodiesterase 4,PDE4)对于调节细胞内cAMP的浓度有重要作用。已有大量的研究表明PDE4抑制剂在体内和体外均具有明确的抗炎作用,此外也有研究表明PDE4抑制剂能通过cAMP/PKA/CREB的通路促进LTP从而具有改善认知的作用,因此PDE4抑制就具有成为治疗与神经炎症相关的中枢神经系统疾病如阿尔兹海默病等极具潜力的药物,然而PDE4抑制剂常伴有的致呕吐不良反应限制了其在中枢神经系统疾病中的应用,Roflupram(罗氟普兰)是人工合成的PDE4抑制剂,化学结构不同于咯利普兰,通过比格犬灌胃给药的方式验证了其不具有致恶心呕吐等不良反应,并且对氢溴酸东莨菪碱所致的大鼠急性学习记忆获得性障碍具有很好的改善效应(数据未显示)。本研究通过利用大鼠海马内注射Aβ25-35致AD模型的方法,研究Roflupram在抗神经炎症方面对大鼠学习记忆障碍的影响。并进一步通过脂多糖(LPS)刺激诱导小鼠BV-2小胶质细胞激活的体外神经炎症模型来评价Roflupram的抗炎作用及机制研究。方法:1、利用SD大鼠双侧海马CA1区微量注射Aβ25-35(10 μg)造成AD的动物模型的方法,验证Roflupram能否改善Aβ25-35诱导的阿尔茨海默病(AD)大鼠的学习记忆障碍,及可能的机制是否与缓解小胶质细胞激活引起的炎症相关。动物分组包括:假手术对照组、Aβ25-35注射组、Aβ25-35注射+盐酸多奈哌齐(1 mg·g-1·d1)组、Aβ25-35 注射+咯利普兰(1 mg·kg-1·d-1)组、Aβ25-35 注射+Roflupram低、中、高剂量组(025mg·kg-1·d-1、0.5mg·kg-1d·1、1.0mg·kg-1·d-1),每组 10 只大鼠。Aβ25-35注射24h后开始药物处理,所有药物均采用灌胃给药,连续给药23天,药物处理12d开始进行进行敞箱实验,14d后进行Morris水迷宫实验(Morris water maze),20d 后进行避暗实验(step-through passive avoidance test)。行为学实验结束后收集海马组织,试剂盒检测海马组织的一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)含量 iNOSR酶活性;采用Western blot法检测海马cAMP下游信号分子(p-PKA、p-CREB),前致炎因子(iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β),胶质细胞激活标记物(GFAP、Iba-1),炎症相关蛋白(p-p38、核内NF-kBp65)的蛋白水平变化,并用RT-PCR的方法分析海马内COX-2、iNOS、IL-1β和TNF-αmRNA水平的变化。2、以BV-2小胶质细胞系为研究对象,利用LPS(1μg/ml)刺激使其激活的方法体外模拟神经炎症模型,来评价Roflupram的抗炎作用。首先,采用MTT法检测 了不同浓度的 Roflupram(6.25～200μM)和 LPS(0.1～20μg/ml)对 BV-2细胞的毒性,确定了 Roflupram和LPS对细胞活力有影响和无影响的浓度范围,接着利用Griess法测定了不同浓度的LPS刺激BV-2小胶质细胞引起的一氧化氮(NO)释放情况,确定了后续试验中LPS使用的浓度(1μg/ml),用不同浓度的Roflupram(5、10、20、40μM)处理观察对LPS刺激引起NO释放的抑制情况,继而确定后续实验中Roflupram使用的浓度(5、10、20μM);利用DCFH-DA荧光探针法检测法和iNOS酶活性测定试剂盒检测了 Roflupram对LPS刺激BV-2细胞活性氧(ROS)和iNOS酶活性的影响;RT-PCR的方法检测了 Roflupram 对 LPS 刺激 BV-2 细胞 COX-2、iNOS、IL-1β和 TNF-α mRNA水平的变化;Western Blot的方法检测了 Roflupram对LPS刺激BV-2细胞p-PKA、p-CREB、p-p38、NF-кBp65(核内)、iNOS、COX-2、IL-1β和 TNF-α蛋白水平的影响;使用PKA的特异性抑制剂H89处理细胞观察Roflupram的抗炎作用与cAMP/PKA/CREB信号通路的关系;最后利用收集LPS刺激和Roflupram处理BV-2细胞的条件培养基来处理小鼠神经瘤母细胞(N2a),用MTT法和hoschest33342染色的方法间接观察Roflupram对炎症引起N2a细胞毒性和凋亡的影响。结果:1.Roflupram改善阿尔茨海默病大鼠的认知障碍及对神经炎症的抑制作用(1)Roflupram对Aβ25-35诱导的大鼠认知功能障碍的改善旷场实验显示,各组大鼠间在5min内的水平得分和垂直得分均没有统计学意义,这表明手术及药物处理并不影响大鼠的自主活动。水迷宫实验显示,在定位航行实验中,Aβ25-35注射组的逃避潜伏期显著延长,差异具有统计学意义(P<0.01)。与Aβ25-35注射组相比较,盐酸多奈哌齐、咯利普兰、Roflupram高剂量均能明显缩短逃避潜伏期,差异具有统计学意义(P<0.05);探索实验中,Aβ25-35注射组在目标象限(第II象限)中游泳时间百分比明显低于假手术组、盐酸多奈哌齐组、咯利普兰组、roflupram高剂量组(P<0.01);Aβ25-35注射组穿越平台次数明显低于假手术组、盐酸多奈哌齐组、roflupram高剂量组(P<0.05,P<0.01),与其余各组差异没有统计学意义。避暗实验显示,适应阶段各组大鼠间的习惯潜伏期进行比较,各组间无显著差异。电击后3h,各组大鼠间潜伏期没有显著差异,表明各组间短时记忆没有差异。电击后24h对各组大鼠长时记忆检测,结果发现,Aβ25-35注射组动物与假手术对照组相比,潜伏期明显缩短差异具有统计学意义(P<0.01),咯利普兰组,盐酸多奈哌齐组,Roflupram中和高剂量较Aβ25-35注射组的潜伏期明显延长(P<0.05,P<0.01)。(2)Roflupram对Aβ25-35诱导的大鼠海马内神经炎症的改善海马组织的NO、ROS含量和iNOS酶活性检测结果显示,Aβ25-35注射海马内NO含量和iNOS酶活性明显升高(p<0.05,P<0.01),各给药组均能不同程度的降低这些指标水平;ROS含量具有升高趋势,各给药组均能不同程度的降低这些指标水平。WB结果显示,Aβ25-35注射组相对于假手术对照组海马内p-PKA和p-CREB的蛋白水平明显下降(P<0.01),而NF-кBp65(核内)、p-p38、COX-2、iNOS、IL-1β、TNF-α、GFAP和iba-1的蛋白水平明显上升(P<0.05,P<0.01),各给药组均能不同程度的逆转这些作用。RT-PCR结果显示,Aβ25-35注射组相对于假手术对照组海马内COX-2、iNOS、IL-1β和TNF-αmRNA水平明显升高(P<0.01),而各给药组均能不同程度的降低这些炎症相关因子的mRNA水平。2.Roflupram对LPS诱导的BV-2小胶质细胞炎症的抑制作用及机制研究(1)LPS诱导的BV-2细胞激活模型的建立MTT实验结果显示在给予细胞不同浓度的Roflupram和LPS处理24h之后,Roflupram在6.25～150μM的浓度范围内对细胞活力没有影响,在200μM的时候出现细胞毒性;LPS在0.1～5μg/ml的浓度范围内不产生细胞毒性,在10μg/ml的时候具有明显的细胞毒性作用。用不同浓度的LPS(0.01～5μg/ml)刺激小胶质细胞处理24小时之后,Griess法检测结果表明随着LPS浓度的增高刺激小胶质细胞的释放的NO水平逐渐升高,并在0.1、1、5μg/ml时差异达到显著水平,由此确定LPS诱导的BV-2细胞激活模型建立所需的LPS浓度为1μtg/ml。(2)Roflupram对LPS诱导的BV-2细胞激活的抑制作用及机制试剂盒结果显示在给予Roflupram(10、20μM)预处理一小时之后加入LPS(1μg/ml)处理24h,可以显著抑制NO的产生和iNOS酶活性的增高,而Roflupram(20μM)处理则可以显著的抑制细胞内ROS的产生。Roflupram对LPS诱导的p-PKA和p-CREB蛋白表达的影响:在给予Roflupram(10、20μM)预处理 1h 后,再加入 LPS(1μg/ml)处理 30min,进行WB实验,结果显示LPS能显著诱导p-PKA和p-CREB的蛋白水平的增高,而Roflupram则能进一步增加这两者的蛋白水平,并且具有剂量依赖性。Roflupram对LPS诱导的BV-2细胞NF-кB p65核转位和p-p38蛋白表达的影响:在给予Roflupram(10、20μM)预处理1h后,再加入LPS(1μg/ml)处理1h,进行WB实验,结果显示LPS能显著增加p-p38和细胞核内NF-кB p65的蛋白水平,而Roflupram则能抑制这两者的蛋白水平的增加,并且具有剂量依赖性。Roflupram 对 LPS 诱导的 BV-2 细胞 IL-1β、TNF-αCOX-2 和 iNOS 蛋白表达的影响:WB结果显示,在给予Roflupram(10、20μM)预处理1h后,再加入LPS(1 μg/ml)处理24h,Roflupram能显著的抑制LPS诱导的IL-1 β、TNF-α、COX-2和iNOS蛋白表达增加,并且具有剂量依赖性。Roflupram 对 LPS 诱导的 BV-2 细胞,IL-1β、TNF-α、COX-2 和 iNOS mRNA水平的影响:RT-PCR结果显示,在给予Roflupram(10、20μM)预处理1h后,再加入LPS(1μg/ml)分别处理6h,Roflupram能显著的抑制LPS诱导的IL-1β、TNF-α、COX-2和iNOS mRNA水平增加,并且具有剂量依赖性。Roflupram的抗炎作用与cAMP/PKA/CREB信号通路的关系:在PKA特异性抑制剂H89存在的情况下,能阻断Roflupram(20μM)引起的p-PKA和p-CREB蛋白水平的升高,并且Roflupram(20μM)对LPS刺激引起p-p38、细胞核内NF-кBp65、TNF-α和iNOS蛋白水平升高的的抑制作用被阻断。说明Roflupram的抗炎作用是通过或者至少部分是通过cAMP/PKA/CREB起作用的。(3)Roflupram对LPS激活BV-2细胞的条件培养基诱导损伤的N2a细胞的保护作用在给予N2a细胞LPS和Roflupram单独或共同处理的BV-2细胞的条件培养基处理24后,通过MTT与hoschest33342染色发现,用Roflupram和LPS处理过的条件培养基相对于LPS单独处理过的条件培养基培养N2a细胞,能显著提高细胞活力与减少细胞凋亡的发生。结论:1.PDE4抑制剂Roflupram能够改善Aβ25-35诱导痴呆大鼠的学习记忆功能障碍,该效应与抑制小胶质细胞的活化、减少炎性因子的表达,从而缓解神经炎症有关。2.Roflupram能抑制LPS诱导的BV-2小胶质细胞的激活及其介导的炎症反应。该作用机制可能为通过抑制胞cAMP的水解,提高细胞内cAMP水平,激活cAMP/PKA/CREB通路并进一步阻断NF-кB p65和p-p38信号通路的活化,从而抑制了下游的炎症相关蛋白和炎症因子的表达。