论文部分内容阅读
目的:本实验选用中药黄芪的主要组份黄芪总皂苷,通过动物实验和细胞实验来探讨黄芪总皂苷是否通过干预Ras/Raf/MEK/ERK信号通路调控自噬缓解肺纤维化,初步探讨黄芪总皂苷缓解肺纤维化的分子机制,为从中医药中寻求多靶点防治肺纤维化提供理论依据,同时为临床防治该疾病提供新的思路。方法:动物实验部分:通过博来霉素气管滴注的方法复制肺纤维化小鼠模型,造模完成后给予黄芪总皂苷灌胃。制作HE染色、Masson染色的病理切片观察空白对照组、模型组及药物干预组小鼠肺组织炎性细胞浸润与胶原沉积的情况;碱水解法检测羟脯胺酸的含量;实时荧光定量PCR(QPCR)法检测一型胶原(Col-I)、三型胶原(Col-III)的m RNA相对表达量;荧光双标的方法检测Col-I、Col-III蛋白的表达水平;WB的方法检测自噬相关基因LC3B-II、P62的蛋白表达水平;蛋白印迹法(Western blotting,WB)的方法检测Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的活化水平。细胞实验部分:MTS法筛选细胞实验最适给药浓度;TGF-β1刺激人肺成纤维细胞造模;给予黄芪总皂苷刺激,荧光双标的方法检测Col-I、Col-III蛋白的表达水平;通过透射电镜观察各组细胞中自噬小数数量的变化;WB的方法检测自噬相关基因LC3B-II、P62的蛋白表达水平;WB的方法检测Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的活化水平;si RNA-ATG7抑制自噬后荧光双标的方法检测胶原相关指标Col-I、Col-III;用Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的抑制剂U0126(MEK抑制剂)、Salirasib(Ras抑制剂)后用荧光双标的方法检测胶原相关指标Col-I、Col-III;以及用透射电镜观察各组细胞中自噬小体数量的变化,MDC染色荧光显微镜下观察自噬小体数量;实时荧光定量PCR法检测自噬相关基因Beclin1、ATG5、ATG7的m RNA相对表达量。结果:动物实验部分:1.用博来霉素气管滴注的方法造模后,模型小鼠肺组织与空白对照组相比出现明显的炎性细胞浸润和胶原沉积的情况,给予黄芪总皂苷干预后,以上症状得到缓解;造模后,模型组小鼠肺组织中羟脯胺酸含量与空白组相比显著升高(P<0.05),给予黄芪总皂苷干预后显著降低(P<0.05);模型组小鼠肺组织中一三型胶原的m RNA表达水平以及蛋白表达水平与空白对照组相比显著升高(P<0.05),黄芪总皂苷干预后显著降低(P<0.05);2.模型组小鼠肺组织中自噬相关基因Beclin1的m RNA表达水平与空白对照组相比显著降低(P<0.05),给予黄芪总皂苷干预后Beclin1的m RNA表达水平与模型组相比显著增高(P<0.05);模型组自噬相关蛋白LC3B-II的表达水平与空白对照组相比显著降低(P<0.05),黄芪总皂苷组与模型组相比LC3B-II的表达水平明显升高(P<0.05);模型组自噬相关蛋白P62的表达水平与空白对照组相比明显升高(P<0.05),给予黄芪总皂苷干预后P62的表达水平显著降低(P<0.05);3.模型组小鼠肺组织中Ras/Raf/MEK/ERK相关蛋白的活化水平与空白组相比明显升高(P<0.05),给予黄芪总皂苷干预后Ras/Raf/MEK/ERK相关蛋白的活化水平与模型组相比明显降低(P<0.05);细胞实验部分:1.用TGF-β1刺激人肺成纤维细胞后,模型组细胞与空白对照组相比一三型胶原的表达量明显升高(P<0.05);给予黄芪总皂苷干预后一三星胶原的表达量明显降低(P<0.05);2.模型组细胞与空白对照组相比自噬小体及自噬溶酶体数量明显降低,自噬相关蛋白LC3B-II的表达水平显著降低(P<0.05),P62的蛋白表达量显著升高(P<0.05);给予不同浓度的黄芪总皂苷干预后自噬小体及自噬溶酶体数量明显升高,自噬相关蛋白LC3B-II的表达水平显著升高(P<0.05),P62的蛋白表达量显著降低(P<0.05);抑制自噬相关基因ATG7后细胞外胶原沉积明显增多;3.模型组细胞与空白对照组相比Ras/Raf/MEK/ERK相关蛋白的活化水平显著升高(P<0.05);给予不同浓度的黄芪总皂苷干预后Ras/Raf/MEK/ERK相关蛋白的活化水平明显被抑制(P<0.05);用Ras/Raf/MEK/ERK通路抑制剂干预人肺成纤维细胞后,细胞外胶原沉积明显减少,自噬小体数量及自噬溶酶体数量明显减少,自噬相关基因Beclin1、ATG5、ATG7的m RNA表达水平显著降低(P<0.05);结论:1、Ras/Raf/MEK/ERK信号通路活化水平与肺成纤维细胞自噬水平呈负相关;与细胞外胶原沉积呈正相关2、自噬水平高低与细胞外胶原沉积呈负相关3、黄芪总皂苷通过抑制肺纤维化小鼠肺组织中Ras/Raf/MEK/ERK信号通路活化而激活小鼠肺组织细胞自噬并缓解肺纤维化小鼠肺组织中胶原沉积。