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以猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株(CSFV C株)为实验材料,首先采用常规细胞实时计数的方法,得到正常犊牛睾丸细胞增殖曲线和带毒睾丸细胞的增殖曲线,结果发现猪瘟病毒不仅不影响犊牛睾丸细胞的生长,反而促进细胞的分裂增殖,培养48小时时,带毒的牛睾丸细胞计数是未带毒细胞的117.5%。初步确立了该毒株在原代犊牛睾丸细胞中增殖的规律与基本特性。再进一步运用直接免疫荧光法确定出最佳细胞初始密度、最佳接毒量及接毒方式的产毒模型,建立了常规的病毒增殖曲线。以建立的细胞及病毒生长曲线及产毒模型为依据,根据GMP生产车间的实际情况,从生产种毒繁殖、原代细胞制备、CSFV的感染、CSFV感染后维持液的调节以及带CSFV的犊牛睾丸细胞的多次传代这几个对CSFV增殖有影响的因素方面入手进一步展开工作。严格控制生产种毒,优质达标的生产种毒,是疫苗病毒含量达标的必要保障。原代细胞制备过程中,依据《中华人民共和国兽用生物制品规程》(以下简称:《规程》)无菌摘取犊牛睾丸,在《规程》的指导基础上,调整消化时间、温度可以同时达到提高细胞数量及质量的双重效果。将《规程》消化时间调整为0.25%的胰酶37℃消化30 min后降低温度继续消化。结果,每1g睾丸组织可制备3×105个/ml细胞悬液400-500ml,是传统消化法的两倍,并且细胞活力明显增强,消化后期降低温度可减轻后期胰酶的作用强度,减少对已消化好细胞的伤害。脾组织毒对次代牛睾丸细胞有很强的刺激作用,生产接毒时适度减少组织毒,同时补入一定量病毒含量≥106细胞毒液,可减少组织毒对细胞的刺激作用,降低细胞的脱瓶率,提高病毒液的收次。在病毒液收获期间,增大维持液量,将《规程》中10%的维持液调节为20%,4天收获一次延长为8天收获一次,经兔体检验,病毒含量仍能达到5×104ml。病毒含量测定方面,应用猪瘟抗原/血清ELISA试剂盒(IDEXX HerdCheck Co.)对经兔体检验已知滴度的20份HCLV半成品细胞病毒液、10份兔体检验检验阴性HCLV半成品细胞病毒液、10份冻干成品疫及10份冻干脾淋苗进行抗原含量测定,并与兔体定型热反应法的结果进行对照,结果半成品检测结果与兔体检验相关率可达95%,成品75%。ELISA法可快速、稳定、简单地运用于HCLV细胞苗的半成品与成品的病毒含量测定,并可反向检测兔体检验的不敏感性,降低检验误判,同时提高产品的质量及产量。