背景骨性关节炎(Osteoarthritis,以下简称OA)又称退行性关节炎、退行性关节病、骨关节病、肥大性关节炎等,是一种多发于中老年的慢性、变形性关节疾病,多累及手的小关节及负重关节。临床上以关节疼痛、变形和活动受限为特点。骨关节病在全世界范围内的发病率相当高,据WHO的最新统计,骨关节病患病率在女性第4位,在男性居第8位,以老年人居多。60岁以上的人口中25%有骨关节病的不同程度表现,如疼痛及功能受限。国内关于骨关节病患病率的报道是8.3%。国外的调查指出,有明显的骨性关节炎X线证据者,在45～64岁年龄组中,男性占25%,女性占30%;我国将60岁以上划为老年,估计到本世纪末,我国进入老龄人口将达1亿。如借用上述国外调查提出的骨性关节炎的发病率粗估,我国仅在老年中的骨性关节炎患者就达5千万左右。骨关节炎的早期X线表现很轻微,但最终可导致关节软骨损害,关节间隙狭窄。骨关节炎的X线片表现特征包括在软骨下骨硬化基础上,有边缘性骨赘形成和软骨下囊肿出现。严重的骨关节炎可导致关节半脱位。但放射学的改变和病人的自我症状可明显不一致。有人报道,40岁以上个体负重关节X线片示:90%以上有骨关节炎的改变,但在X线片上有异常改变的关节只有30%有症状。骨关节炎尚缺乏治愈的手段。目前倡导的理想的治疗方法应是全面的,通过分析患者的关节结构和保持的功能及可能涉及到的致病因素,全面掌握患者所需的关节恢复和使用程度,设计一个个性化的治疗方案。包括患者宣教,尽可能消除可能的致病因素,选择患者最为合适的药物,必要时适当的手术治疗,术后合理的进行功能锻炼。同时,也可用于中药治疗,以消除病因,缓解症状,提高生活质量,并最后达到临床治愈的共同目标。膝骨性关节炎(KOA)亦称退行性骨关节病、骨质增生,是一个以关节软骨退行性改变为核心,累及骨质并包括滑膜、关节囊及关节其他结构的全方位、多层次、不同程度的慢性炎症;是一种无菌性、慢性、进行性侵犯关节,特别是负重关节的疾病。本病在中年以后多发。据有关资料报道,美国在关节炎患者当中,膝骨性关节炎占43%,65岁以上的人群中90%的女性和80%的男性患有膝骨性关节炎。国内的初步调查显示,膝骨性关节炎的总患病率约为15%,40岁人群的患病率为10%-17%,60岁以上则达50%。而在75岁以上人群中,80%患有膝骨性关节炎,该病的最终致残率为53%。参与骨关节炎的致病因子,如IL-1、IL-6,肿瘤坏死因子(TNF)等大家都已熟知,新近又有NO、.细胞凋亡、性激素、瘦素、骨保护素参与软骨代谢或致病因子等发现。目前认为滑膜炎在骨关节病中起重要作用,已证明这一过程与OA组织中蛋白水解酶,金属蛋白酶活性增高密切相关,而与滑膜分泌的细胞因子IL-1,TNF-α等对金属蛋白酶和其他蛋白水解酶的合成起着重要调节作用。实验测得OA患者软骨、滑膜中NO含量较高。NO对软骨的损伤通过两个途径:①高浓度NO抑制细胞腺立体。②NO通过酸性环境,分解的自由基OH-,具有很强的细胞毒性,过量的NO可增加胶原酶和金属蛋白酶活性,抑制基质蛋白多糖的合成,增加II型胶原裂解,从而造成软骨损伤。通过对骨关节炎患者的软骨内加NOS抑制剂,结果实验组NO释放量较对照组明显减少,NOS的活性也明显降低,结论NOS抑制剂能抑制过量的NO释放,改善软骨代谢环境,对软骨有一定的保护作用。细胞凋亡是区别于细胞坏死的另一种细胞死亡形式,细胞死亡时无细胞内容物暴露,几乎不导致炎症反应,研究发现OA软骨细胞凋亡明显高于正常组织,离体实验NO可诱导软骨细胞凋亡、而氧自由基则导致软骨细胞坏死,研究还发现软骨细胞凋亡位于软骨浅层和中层。深层细胞凋亡,可能为伴有炎症时、T细胞产生的Fas-1导致的软骨细胞凋亡、因此细胞凋亡是OA发病的重要环节。瘦素Leptin是人体多个器官均可分泌的一种分泌型蛋白质,它主要由白色脂肪组织产生,其他如棕色脂肪,骨骼肌,胃粘膜等均可分泌Leptin,从肾脏降解后排除。Leptin进入血液后与Leptin结合蛋白结合传导至下丘脑,从而影响神经肽等多种内分泌激素的分泌,其生理功能:感受机体的营养状态,抑制食物进入,刺激或维持能量消耗,影响生殖,内分泌系统。Leptin抑制骨形成,对破骨细胞没有作用,Leptin中枢性抑制骨形成的作用机理阐明,使人们对骨质疏松等代谢疾病的病因有了崭新的认识,抑制瘦素合成、促进清除、降低Leptin的水平,可能成为骨质疏松等代谢性骨病的有效治疗手段。骨保护素OPG(osteoprotegerin)又称破骨细胞形成抑制因子,体内多种器官组织合成OPG,OPG可显著抑制生理,病理情况下骨吸收,体外培养下,雌激素可使成骨细胞株分泌OPG增加3-4倍,由此提示绝经后雌激素水平降低,进而影响OPG分泌,与绝经后骨质疏松的发生有关。研究发现性激素对关节软骨代谢有调节作用,已证明性激素受体存在于关节软骨细胞,滑膜组织、骨细胞。而OA的发病部位也主要是上述部位,资料显示,雌雄激素对骨关节软骨均有保护作用,机制十分复杂,一般认为内源性雌激素的减少可能是OA的危险因素之一,外源性雌激素对OA有保护作用。流行病学研究还揭示了一个有趣的现象,即妇科手术子宫切除对膝关节OA有保护作用。实际上功能性子宫出血和子宫肌瘤体内雌激素水平过高,并非手术切除子宫的作用。性激素通过相应的细胞核受体结合来实现其作用。除生殖系统外,骨与关节、免役系统、内分泌系统中下丘脑→垂体→肾上腺轴的功能也均与性激素有密切关系。许多细胞因子与OA有关,如IL-1(白介素1)性激素对这些细胞因子中某一种或多种因子具有直接抑制效应。糖皮质激素一直用于OA关节的局部治疗。研究显示,性激素通过下丘脑→垂体→肾上腺轴对糖皮质激素调节,间接抑制炎症细胞因子产生,对关节软骨起保护作用。近年发现,OA关节软骨细胞外基质合成与降解失衡是造成软骨变性的重要原因之一。其中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)可能起决定性作用。研究结果显示MMPs在关节炎发病时能够对关节软骨外基质进行降解,使关节软骨肿胀,抗外力作用下降,最终导致关节软骨进行性破坏。而以往研究表明,关节软骨的主要成份是Ⅱ型胶原,因此基质金属蛋白酶对软骨的破坏主要是源于对Ⅱ型胶原的水解。MMP-13是在对乳癌组织研究时被发现与鉴定出来的,MMP-13在正常组织中不表达,而在OA软骨细胞中有高表达。MMP-13能够对Ⅱ型胶原的氨基酸残基片段进行裂解而导致Ⅱ型胶原的破坏。关节是骨骼的连接处,骨骼运动的枢纽。肌肉是运动的动力。构成两关节骨相对的表面称为关节面,关节面全部被关节所包裹,除了身体上有少数关节的关节软骨属于纤维软骨,其余的都是透明软骨。关节软骨使到关节头和关节窝的形态能够更好地相适应,表面光滑,表面有少许滑膜液,摩擦系数小于冰。因此,运动更灵活,因为软骨的灵活性及弹性的存在,从而承担了沉重的负荷和缓慢的冲击。关节软骨上无神经血管分布,滑膜层关节囊血管通过渗透作用对其进行养分供应。关节软骨主要由胶原纤维、蛋白多糖、软骨细胞和水分所组成,而Ⅱ型胶原是构成胶原纤维的重要成份。各型胶原在软骨内的排列高度有序,表现在Ⅱ型胶原、Ⅸ型胶原、Ⅺ型胶原组成的软骨内纤维网架结构。该网架结构构成软骨的骨架,如遭到破坏,软骨就不能维持正常的结构和功能。Ⅱ型胶原构成纤维网架结构中的主体,生理状况下,软骨基质胶原的合成和降解维持动态平衡。在骨关节炎的软骨中,当软骨细胞造成轻度损伤是会出现代谢活跃,合成代谢增强,增加Ⅱ型胶原的合成,同时增加与Ⅲ型胶原相关;当关节出现造成中度损伤时,Ⅱ型胶原在软骨中间层和深层的合成都会增强,伴有变性的存在,整体上主要表现出合成;重度损伤所致骨关节炎软骨中,Ⅱ型胶原变性、溶解的速度明显大于合成,使得Ⅱ型胶原纤维的数量明显减少,主要位于单个和簇聚软骨细胞周围。β-catenin是Wnt信号通路中起到关键作用的信号因子。在成熟的软骨细胞及细胞内β-catenin终止软骨细胞分化是防止软骨内成骨,这是骨关节软骨退化的病理学的一个重要机制。软骨表面的β-连环蛋白增高能够令到的软骨细胞出现肥大和增生、细胞外基质(ECM)的分泌停止,增加MMP-13表达,导致软骨组织损伤的结构出现。阿仑膦酸钠是一种抗骨质疏松药,疗效肯定。本品为磷酸盐骨吸收抑制剂,直接作用于破骨细胞,抑制破骨细胞的活性,使骨转化降低、骨重建点的数量减少,在重建点的骨的形成大于骨的吸收,阻止骨质溶解,使骨密度增加。临床研究结果显示,阿仑膦酸钠能显著降低椎骨骨折发生风险效果明显优于依替膦酸钠、雷洛昔芬和降钙素;显著增加骨密度、降低骨转化;一项最新研究显示,骨质疏松症患者每周服用一次阿仑膦酸钠比每天服用一次依从性更好,上消化道反应更小,并且每周一次的剂量对于改善骨骼强度的作用与每天一次同样有效。目的:本研究分别从动物实验及细胞实验两部分去探讨阿仑膦酸钠干预膝关节炎大鼠的ColII、MMP-13及β-catenin表达变化,以及相关的调控分子机制,为阿仑膦酸钠治疗膝关节炎提供理论依据。方法1.通过佐剂大鼠关节腔注射建立急性膝关节炎病理改变,并通过阿仑膦酸钠干预,用Western blot、RT-PCR及免疫组化等方法检测ColII、MMP-13及β-catenin表达变化及关节病理组织形态学改变。2.通过IL-1β诱导软骨细胞建立膝关节炎细胞模型,给予阿仑膦酸钠干预用Western blot、RT-PCR 等方法检测 ColII、MMP-13 及β-catenin 表达变化。3.通过IL-1β诱导软骨细胞建立膝关节炎细胞模型,使用Wnt及NFκB信号通路激动剂,探讨阿仑膦酸钠的作用机制。结果1.采用佐剂诱导大鼠膝关节炎病理模型是成功的,可以看到模型组关节肿胀,关节面光滑,胶原消失,透明软骨外漏。镜下细胞排列紊乱,软骨剥脱,大量炎性细胞浸润。在关节炎评分中,模型组显著高于对照组。2.进行阿仑膦酸钠40mg/Kg进行腹腔注射,每周1次,连续注射4周后,对各指标进行评价,结果显示,ALN干预后关节面得到一定修复,胶原增加,软骨剥脱程度降低;镜下可以看到细胞排列相对平均、软骨溃疡情况明显减少,炎性细胞浸润减少。关节炎评分也较原来的明显下降,与模型组比较有显著的统计学差异。3.分别对关节液中的IL-1β、TNF-α及HA浓度进行检测,结果显示,模型组与正常对照组比较,IL-1β和TNF-α均有明显升高,而经过阿仑膦酸钠干预后有明显的下降;HA的情况则是相反。4.MMP-13和β-catenin蛋白的表达在IL-1β诱导后有显著的增多,在同时给予10ng/ml的阿仑膦酸钠与IL-1β共孵育后,MMP-13和β-catenin蛋白的表达较IL-1β单独组有明显的下降;Col Ⅱ蛋白的表达趋势则与上述两个蛋白表达相反。5.使用RT-PCR再次验证,发现跟蛋白表达趋势相一致,IL-1β诱导后MMP-13与β-catenin mRNA表达明显上调,阿仑膦酸钠干预它们的mRNA表达又有显著的下降;Col Ⅱ的mRNA表达趋势与上述两个基因表达趋势相反。6.免疫组化检测显示在软骨细胞中IL-1β诱导后MMP-13和β-catenin表达增多,阿仑膦酸钠干预能够抑制他们的表达;Col Ⅱ的情况与之相反。7.在软骨细胞中IL-1β诱导后培养上清中MMP-13和β-catenin浓度增多,阿仑膦酸钠干预能够抑制他们的表达;Col Ⅱ的情况与之相反。8.IL-1β诱导软骨细胞后Wnt1及NF-kB的mRNA与对照组比较有明显上调,阿仑膦酸钠干预后,两者的mRNA表达显著下调。9.使用20mM浓度的LiCL刺激软骨细胞,能够看到Wnt1、β-catenin、NF-kB及MMP-13与各自对照组比较,均有明显的mRNA表达上调,而Col Ⅱ的mRNA则表达下降。10.使用10mM浓度的PDTC刺激软骨细胞,能够看到Wnt1、β-catenin的mRNA与对照组比较无统计学差异;NF-kB及MMP-13与各自对照组比较,均有明显的mRNA表达上调,而Col Ⅱ的mRNA则表达下降。结论[1]使用佐剂大鼠关节腔注射方式能够快速复制出膝关节炎病理改变。[2]阿仑膦酸钠通过整体调节作用能够上调软骨细胞Ⅱ型胶原的表达、下调MMP-13及β-catenin的表达,调节关节软骨基质胶原的生成与降解的平衡。[3]阿仑膦酸钠通过抑制Wnt1信号通路从而导致NF-κB活化受阻,并最终调节MMP-13、β-catenin及Col Ⅱ的表达。