目的:蟹体内含有多种蛋白质,每种蛋白质均可能成为过敏原;同时,前期结果已证实,不同蟹过敏患者之间的过敏原组分具有明显的异质性。因此,单组分分析逐渐成为制备用于蟹过敏患者体外诊断和个体化治疗的标准化抗原的基础。本研究希望找到蟹中未引起重视的过敏原,证实该过敏原在中华绒螯蟹过敏中起重要作用;同时,从分析过敏原的主要抗原表位入手,构建关键抗原表位串联体并评估其免疫活性,探讨用该重组蛋白代替天然蛋白用于中华绒螯蟹过敏患者体外诊断和个体化治疗的可能。方法:1.血蓝蛋白是中华绒螯蟹中一种重要的高分子量过敏原:采用裂解液法提取获得中华绒螯蟹总蛋白,通过SDS-PAGE、二维(2-D)电泳及Western blot技术分析蛋白提取液中的过敏原组分,再通过质谱技术鉴定蟹中未知的过敏原。以临床蟹过敏患者的血清sIgE作为识别抗体,通过斑点免疫印迹实验检测疑似蛋白的反应频率,证明该疑似蛋白是中华绒螯蟹中一种重要的高分子量过敏原。2.血蓝蛋白抗原表位分析及关键抗原表位筛选:通过三种线性抗原表位预测软件(DNAstar Protean system,ABCpred和Bepipred Antibody Epitope Prediction)分析血蓝蛋白中可能的抗原表位,筛选有重叠的肽段作为候选抗原表位,然后采用斑点印迹的方法,以14例蟹过敏患者血清作为一抗,分析候选抗原表位的反应频率,并筛选反应频率最高的三段抗原表位作为关键抗原表位。3.关键抗原表位串联体的构建及免疫学活性鉴定:将编码关键抗原表位的DNA序列进行串联,并构建到pET-28a质粒中,然后,将重组质粒转入Rosetta感受态细胞中,进行目的蛋白的异源表达,之后利用镍柱纯化获得目的重组蛋白。同时,重组表达中华绒螯蟹的全长血蓝蛋白,用于关键抗原表位串联体的免疫学活性鉴定。最后,采用SDS-PAGE、Western Blot鉴定目的重组蛋白,并通过ELISA、斑点抑制实验及ELISA抑制试验评估目的重组蛋白的免疫学活性。结果:1.血蓝蛋白是中华绒螯蟹中一种重要的高分子量过敏原:通过SDS-PAGE及2-D电泳的结果分析,证明本实验所提取的中华绒螯蟹总蛋白组分完整。Western blot结果显示,中华绒螯蟹总蛋白提取液中至少有18种能与阳性血清反应的蛋白组分。其中,分子量为70~80 kDa之间的两个蛋白处于同一等电点,可能为同一种蛋白质,且均能与阳性患者血清反应,是中华绒螯蟹中的过敏组分。质谱分析结果显示两个疑似蛋白均为中华绒螯蟹的血蓝蛋白。斑点免疫印迹结果显示血蓝蛋白与过敏患者血清的反应频率为61%,证明血蓝蛋白是中华绒螯蟹中一种重要的高分子量过敏原。2.血蓝蛋白抗原表位分析:利用抗原表位预测软件筛选获得10条候选抗原表位。在斑点印迹实验中,所筛选的10条候选表位肽段均能与至少一例阳性血清反应。我们将各候选表位与sIgE的反应频率进行统计,只有表位E1、E2和E4的反应频率大于40%,我们筛选1、2、4号抗原表位作为关键抗原表位。3.关键抗原表位串联体的构建及免疫学活性鉴定:将筛选获得的3个关键抗原表位串联表达及纯化后,获得的目的重组蛋白分子量约为12 kDa,可以良好的区分过敏血清及非过敏血清(P<0.001),并且能够明显抑制全长血蓝蛋白与过敏血清之间的反应,抑制率在26~63%之间,均值为50%,剂量-反应曲线呈S型,当抑制剂rHc浓度为500μg/ml时,抑制率可达到93%。结论:1.血蓝蛋白是中华绒螯蟹中重要过敏原之一,具有较强的致敏活性;2.生物信息学预测的10个候选抗原表位,均为血蓝蛋白的抗原表位,预测结果较准确;3.采用分子生物学技术所制备的关键表位串联体,具有良好免疫活性,可以作为蟹过敏体外诊断试剂盒及个体化脱敏治疗的候选蛋白。