p53蛋白,也被认为是肿瘤的抑制蛋白。自从发现以来,被证实参与细胞周期调控,激活DNA修复、维持基因组稳定及促进细胞凋亡。在超过50%的人类的癌症中都出现p53功能缺失,其中就包括单位点和多位点的突变及结构的扭曲。同样也有越来越多的研究证实,p53蛋白的突变,使得其空间构象发生变化,从而失去对细胞周期调控与促进细胞凋亡的重要生物学功能,与此同时,还会得到新的功能(Gain-of-Function, GOF),如促进细胞转移、侵染等,由抑癌基因变为癌基因。目前越来越多的研究组开始关注p53蛋白突变体的研究,其中就包括促进突变体的回复突变及抑制其生物学功能。此项研究对于癌症的靶点治疗具有重要的生物学研究与医学价值。核酸适配体(aptamer)是一段短的单链核酸分子,其特点是能够根据结构特异性针对性地地结合多种靶标分子,如蛋白质、小分子、糖、脂肪等。它是由一个叫SELEX (Systematic Evolution of Ligand Exponential enrichment)的体外筛选进程得到的。SELEX技术自从1990年由三个研究组同时发明并已广泛地运用到诸如核糖体开关、靶向治疗等生物及医学应用。于是我们有理由相信,通过此筛选方法,我们也可以筛选到对诸如p53突变体有高亲和力和特异性的核酸适配体。目前,还未见研究组筛选到p53突变体适配体的报导。在本论文中,我们的首要研究目的就是能够筛选到p53R175H的适配体。由于此突变型与野生型的唯一区别只在于第175位的氨基酸突变,所以我们对传统的SELEX筛选过程进行了改进,名为差别竞争SELEX筛选,将p53野生型与突变型蛋白质分别经过固相偶联,同时投入体系中,竞争性地结合库分子,最大限度地增加筛选特异性与差异性。经过5轮的差别竞争SELEX筛选,我们得到了21个p53R175H蛋白的候选适配体。通过亲和力检测,适配体p53R175H-APT与p53R175H蛋白的亲和力大大超过对于野生型p53的亲和力,并且在凝胶迁移实验中我们最终确定p53R175H-APT能够在体外和p53R175结合。所以我们最终确定的p53R175H-APT作为我们后续研究的对象。尽管在亲和力检测中,p53R175H-APT对于p53突变体有着相对于野生型p53较强的亲和力,但其细胞学效应还有待研究。在本论文中,我们试图阐述筛选到的适配体P53R175H-APT在细胞中的功能。首先,我们必须确定P53R175H-APT在其靶标的选择上具有严格的特异性。在含有p53野生型的HEK293T和HeLa细胞中,通过将p53R175H-APT转染入上述两种细胞中,无论从表型还是从细胞生长于凋亡的情况看,均没有发现与对照组有显著性差异。同时,在只含有p53的另一个突变体p53R273H的H1299细胞中,经过转染p53R175H-APT,相对于对照组我们依然没有观察到明显的差别。在完成了以上实验证实p53R175H-APT对于含有p53野生型与p53其他突变体的细胞没有显著性作用之后,我们将此适配体构建到质粒并转染入H1299-p53R175H稳转细胞系中,我们发现,经过p53R175H-APT处理的细胞,细胞增殖得到明显的抑制,细胞的死亡明显增多。而对于含有p53野生型的细胞,则没有此现象。侧面说明此RNA适配体可以特异性地识别p53R175H并显著影响细胞增殖与细胞凋亡。为了更加确定产生如此明显的生物学差别与p53突变体相关,我们通过p53的免疫沉淀证实了在细胞中,p53R175H-APT与p53突变体结合的确大于IgG和scramble序列对p53突变体的结合能力。与此同时,通过克隆形成实验与soft agar实验我们证明了通过此适配体处理的细胞,其恶性程度与生长能力也有明显降低。由于很多p53的突变属于功能获得型突变,肿瘤细胞的迁移能力会不同程度地提高。为此我们设计了Transwell迁移实验和wound healing实验,证实经过此适配体处理过的细胞其迁移能力得到明显降低。进一步,在分子水平上,p53R175H-APT处理的细胞表现出更像p53野生型的调控方式,多个p53相互作用基因均有激活,一定程度上说明此适配体可使p53突变体的功能回复。同时,我们通过免疫荧光更加直观地证明了,经过p53R175H-APT处理过的p53突变体,能够从构象上使其回复成p53野生型。为了从更高水平验证此效应可以运用到实体瘤的治疗中,我们建立了裸鼠肿瘤模型,并将适配体通过实体瘤注射与静脉注射两种方法进行治疗。相对于对照组,适配体组的裸鼠肿瘤明显减小并维持较低水平,甚至消失。通过对实体瘤切片的TUNEL凋亡检测染色,我们发现在适配体治疗组中的凋亡细胞明显多于对照组。更加证实了p53R175H-APT可以通过p53R175H作用于肿瘤细胞,促进肿瘤细胞的凋亡、降低细胞生长能力、限制肿瘤细胞的迁移及具有一定程度的临床潜力。综上所述,本论文的研究成果阐述了一个新的SELEX筛选方法,并通过此方法成功筛选出与野生型p53只有一个碱基差异的p53R175H的适配体p53R175H-APT。体外实验证实其可以抑制肿瘤细胞生长并促进其凋亡,体内实验进一步证实了其潜在的临床价值,对于肿瘤靶向治疗提供新的思路。