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第一部分稳定表达EGFP-TDP-43蛋白的NSC-34细胞模型构建目的建立稳定表达p DEST30-EGFP-TDP-43蛋白的NSC-34细胞系。方法:构建p DEST30-EGFP、p DEST30-EGFP-TDP-43-WT、p DEST30-EGFP-TDP-43-M337V三种真核表达载体,应用成熟的转染技术将这三种质粒分别导入到NSC-34细胞中,并用G418试剂筛选出能稳定表达的细胞株。真核细胞中EGFP、EGFP-TDP-43-WT、EGFP-TDP-43-M337V的表达分别用荧光显微镜、RT-PCR、Western blots方法检测,并利用该稳定表达细胞系观察细胞氧化应激产物MDA的表达情况。结果:成功获得经转染并通过G418反复筛选的p DEST30-EGFP-NSC-34细胞系、p DEST30-EGFP-TDP-43-WT-NSC-34细胞系、p DEST30-EGFP-TDP-43-M337V-NSC-34细胞系,利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光的表达率,约占全部观察细胞的95%以上,RT-PCR及Western blots结果均证实了仅野生组及突变组外源TDP-43在基因水平及蛋白水平的表达,MDA法测定三组细胞内氧化应激中,突变组较空转组及野生组明显升高(P<0.01,n=5),而空转组与野生组相差不大,无统计学意义。结论:用p DEST30-EGFP、p DEST30-EGFP-TDP-43-WT、p DEST30-EGFP-TDP-43-M337V三种质粒转染的NSC-34细胞经G418筛选,可以成功构建p DEST30-EGFP-TDP-43蛋白稳定表达的细胞系,进而为后续肌萎缩侧索硬化功能实验提供有用的细胞研究模型。第二部分Maf K蛋白及JDP2蛋白在突变型TDP-43转染的NSC-34细胞中的表达及对Nrf2/ARE通路的影响目的探讨在突变型TDP-43转染的NSC-34细胞模型中,Maf K蛋白及JDP2蛋白表达情况,及是否对Nrf2/ARE通路产生影响,为进一步研究ALS的发病机制提供依据。方法1、引入第一部分构建好的ALS细胞模型;引进已获得稳定表达TDP-43的NSC-34细胞株。2、建立三个组。包括空转型、野生型及突变型,分别进行以下操作:1)利用Western blots及电泳技术检测各组细胞中总的Nrf2的变化及下游Ⅱ相解毒酶如NQO1的表达;检测胞浆、胞核内Nrf2表达水平。2)利用丙二醛(MDA)试剂盒检测氧化应激的水平。3)利用免疫组化试剂盒观察细胞形态学变化。4)利用MTT检测试剂盒检测细胞凋亡及细胞活性的变化。3、分别在三个组中检测Mafk蛋白的表达情况。利用Western blots及电泳技术检测Mafk蛋白的表达情况。4、分别在三个组中检测JDP2蛋白的表达情况。利用Western blots及电泳技术检测JDP2蛋白的表达情况。结果1、成功构建稳定表达p DEST30-EGFP、p DEST30-EGFP-TDP-43-WT、p DEST30-EGFP-TDP-43-M337V三种蛋白的细胞系,分别是空转组、野生组、突变组。2、免疫组化结果示:转染p DEST30-EGFP-TDP-43-M337V质粒的细胞系细胞胞体变圆,突起减少、变短。3、MDA实验结果示:突变组细胞MDA水平较正常组和野生组明显增高,(P<0.05),而空转组和野生组间无明显差异(P>0.05)。4、Western blots结果示:突变组总的Nrf2表达降低,且Nrf2核内积聚,但下游效应因子如NQO1表达却减低,与空转组和野生组比较,差异有统计学意义(P<0.05)5、MTT结果显示:突变组MTT值明显低于空转组及野生组,差异有统计学意义(P<0.001),而空转组与野生组间无明显差异(P>0.05)。6、在Western blots水平,突变组细胞中Maf K表达量明显降低,与空转组及野生组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。7、在Western blots水平,突变组细胞中JDP2表达量也明显降低,与空转组和野生组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在新构建的突变型TDP-43转染的NSC-34细胞模型中,细胞抗氧化应激水平减低,抗氧化能力受损;Nrf2/ARE抗氧化应激通路的下游效应因子表达减少;存在Nrf2表达的核内积聚;参与Nrf2/ARE通路的两个顺式作用元件MAFK及JDP2表达量与正常细胞存在差异,主要表现为是Maf K蛋白及JDP2蛋白表达均减少。抗氧化应激通路产物NQO1的表达量下降可能与这两个蛋白量的变化有关联,具体发病机制还有待进一步研究。