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【目的】构建两种新型抗人CD45哺乳动物细胞表达表达载体,利用DHFR系统筛选出能稳定高表达抗CD45基因工程抗体的细胞株,为以人CD45为靶点的研究奠定基础。【方法】(1)PCR扩增得到抗CD45抗体的轻链可变区VL区和重链可变区VH区基因,通过基因工程技术构建抗人CD45抗体的真核表达载体,得到Anti-CD45-scFv-Fc与pBudce-CD45[H+L]。(2)将两者转染HEK-293T细胞获得瞬时转染表达,用Elisa方法检测两种真核表达载体的抗体表达量的差异。用流式细胞术检测两种抗体与CD45-/+细胞系的结合。(3)采用抗原抗体系统和生物素亲合素系统Western blot方法,鉴定抗体与CD45分子的结合特异性。(4)挑选表达量较高,结合活性好以及具有结合特异性的抗体用于后续实验研究。筛选出稳定高表达Anti-CD45-scFv-Fc的DG44-CHO细胞株。【结果】(1)通过分子生物学技术将抗体基因片段分别克隆至载体,得到载体Anti-CD45-scFv-Fc与pBudce-CD45[H+L],经测序鉴定显示其载体DNA序列正确,表明两种哺乳细胞表达载体均构建成功。(2)用Elisa方法检测Anti-CD45-scFv-Fc与pBudce-CD45[H+L]两种载体转染HEK-293T细胞后的抗体瞬时表达量分别为2mg/L和0.3mg/L。(3)采用流式细胞术检测结果表明,Anti-CD45-scFv-Fc载体表达的抗体与CD45+多种细胞株(KG1a,K562,Jurkat)结合活性接近单克隆抗体,而与CD45-的多种细胞株(HepG2,A549,B16,HU)结合活性低。pBudce-CD45[H+L]载体表达量过低,因此选择表达量高的Anti-CD45-scFv-Fc载体用于后序实验。(4)Western blot鉴定结果表明Anti-CD45-scFv-Fc载体表达的抗体与高表达CD45分子细胞株总蛋白在250kD处有结合条带,符合CD45分子理论值170-250kD,而与不表达CD45分子的细胞株总蛋白在相同位置无结合条带。同时,Anti-CD45-scFv-Fc抗体与生物素标记的人CD45(rhCD45)作用,HRP标记的亲和素显色,还原抗体与非还原抗体分别在约60kD和120 kD处有结合,符合单价抗体(包含Fc段)与双价抗体分子量大小,证实所构建的载体转染哺乳动物细胞成功表达双价抗体,并可与CD45分子的特异性结合,达到了预计形成的抗体结构模式。(5)用DHFR系统筛选获得了稳定转染Anti-CD45-scFv-Fc的DG44-CHO细胞,并证实了该系统对抗体的结合活性等无明显影响,可大量表达抗体进行后续效应实验。【结论】成功改造鼠源性单克隆抗CD45抗体,构建了表达抗人CD45抗体的哺乳细胞表达载体Anti-CD45-scFv-Fc,DHFR系统筛选获得稳定高表达Anti-CD45-scFv-Fc的DG44细胞株。