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骨缺损的修复是骨修复医学领域所面临的难题,而骨组织工程发展为骨缺损的修复提供了新的研究方向。医用钛金属材料具有良好的机械性能和生物相容性,因此,以其作为骨组织工程支架材料的相关研究得到广泛的报道。但是,钛金属材料表面不具有生物学活性,容易导致受体骨组织从植入的钛金属材料表面脱落。所以,探索如何提高钛金属材料表面的生物学活性成为该领域亟待解决的科学问题。骨形态发生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)是骨形成和发生过程中重要的调控因子,并且能够诱导骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞方向分化,进而被广泛的用于提高骨组织工程支架材料表面的生物学活性。有研究发现,3,4-L-二羟基苯丙氨酸(3,4-L-dihydroxyphenylalanine,DOPA)能够粘附在Au、Ag、Ti O2等多种金属材料表面。因此,以DOPA作为媒介,将BMP-2固定到钛金属材料表面,对于提高钛金属材料表面的生物学活性具有重要意义。本课题通过基因工程的方法将酪氨酸重复序列(Tyrosine-lysine-tyrosinelysine-tyrosine,YKYKY)整合到BMP-2的基因序列末端,并利用大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)将其进行表达;利用快速蛋白液相色谱(Fast protein liquid chromatography,FPLC)将大肠杆菌表达的蛋白质进行纯化,然后,通过酪氨酸羟化反应完成DOPA的转化;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)和免疫印迹等方法对蛋白质的大小、纯度和特异性进行鉴定;利用液相色谱串联质谱法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)确定YKYKY中的酪氨酸是否被氧化转变为DOPA;通过圆二色光谱法(Circular dichroism spectrum,CDS)和ELISA法对蛋白质的生物学活性进行分析和检测;通过扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)、能谱仪(Energy dispersive spectrometer,EDS)和耗散型石英晶体微天平(Quartz crystal microbalance with dissipation,QCM-D)对固化后材料的表面、碳元素特征峰和生长因子含量的改变进行分析;利用小鼠成肌细胞和人骨髓间充质干细胞与固化的钛金属材料共培养实验,测定经过固化后钛金属材料成骨诱导能力的改变;最后,通过体内实验进一步确定固化的钛金属材料表面钙元素的累积情况。实验结果表明:所构建的BMP-2-YKYKY质粒能够在E.coli中表达,且所获得的目标蛋白质经过纯化后具有较高纯度,进一步通过分子量和特异性的鉴定,确定所获得的目标蛋白质为BMP-2-YKYKY;经过羟化反应后,BMP-2-YKYKY中的3个酪氨酸均被羟化成为DOPA,同时,羟化后的蛋白质溶液仍然具有较高的纯度;通过生物学活性鉴定,发现YKYKY和DOPA的加入并没有对BMP-2的生物活性功能区的结构产生影响;并且,经过修饰的BMP-2不仅生物学活性几乎没有变化,而且具备了DOPA的粘附能力(在p H=8.5时,粘附能力最强);BMP-2-XKXKX能够显著改变钛金属材料表面的粗糙程度,提高BMP-2在钛金属材料表面的粘附量(表面的生长因子含量达到631.43ng/cm2);经过BMP-2-XKXKX修饰后的钛金属材料具有较强的成骨诱导能力,不仅能够显著促进小鼠成肌细胞(C2C12-BRE-Luc)内双荧光素酶(DualLuciferase)的表达,而且可以显著促进人骨髓间充质细胞内碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)和成骨相关基因RUNX2、OSTERIX和ALP的表达,抑制干性基因OCT4、NANOG和SOX2的表达;进一步的体内实验表明,经过BMP-2-XKXKX固化的钛金属材料能够促进钙元素在材料表面积累。综上所述,本课题以DOPA作为媒介,将BMP-2固定到钛金属材料表面,探索固化后钛金属材料表面的生物学活性改变。结果提示,DOPA的引入不仅能够保持BMP-2的生物学活性,而且可以促进BMP-2在钛金属表面的粘附,提高钛金属材料表面的生物学活性,增强钛金属材料的成骨诱导能力,为钛金属材料的临床应用奠定了实验基础。