研究背景:急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)是心血管危害最大的心血管疾病之一。AMI后患者罹患抑郁症的风险明显增加,大约15～30%的心梗患者存在抑郁症状。AMI合并抑郁的发生不仅影响心梗后患者的生活质量,还可能会进一步加剧心肌细胞的死亡,导致心脏功能的下降甚至心脏性猝死的发生。然而,现有抗抑郁药对心梗后抑郁患者的治疗仅能改善其临床抑郁症状,并不能改善心梗患者的预后,降低死亡率。因此深入探讨心梗后抑郁的发病机制,针对作用靶点选择针对性药物治疗是值得探讨的研究课题。现有证据证实omega-3脂肪酸既有保护心血管的作用,同时也能改善患者的轻-中度抑郁状态,可能可以作为治疗心梗后抑郁的新型药物。omega-3脂肪酸则主要分为EPA和DHA两种成分。大量的研究已经证实了 omega-3脂肪酸的心血管保护作用,美国冠心病指南和欧州心衰指南都推荐服用omega-3脂肪酸来防治相关心血管疾病。2018年新英格兰医学杂志发表的大型随机对照临床研究结果提示EPA既可用于心血管的二级预防也可以用于一级预防,指出在使用他汀类药物但甘油三酯水平仍控制不良的患者每天摄入足量EPA可明显降低缺血性事件(包括心血管死亡)的风险。此外,本课题组既往研究也发现富含omega-3脂肪酸的fat-1转基因小鼠心梗后细胞凋亡程度较WT小鼠减轻,心功能较之好转。提示omega-3脂肪酸可以下调心肌梗死后心肌细胞凋亡的发生进而保护心梗小鼠的心功能。同时omega-3脂肪酸可增强抗抑郁药物的疗效,亦可减轻心梗后患者的轻度抑郁症状。新近研究也发现omega-3脂肪酸可通过抑制ROS通道活化对缺血再灌注损伤的大脑皮层神经元其保护作用。然而,国内外尚未有研究进一步证实omega-3脂肪酸对心梗后抑郁的疗效。AMI损伤后会引发无菌性的炎症诱发进一步的心脏损伤,同时也可以进一步引发全身的不良反应。既往的研究提示MI过后的炎症反应可能是心梗后抑郁的其中一个发病机制。AMI发生时,心肌组织供血减少,再灌注过程发生强烈的无菌性炎症反应进一步加重心肌损伤。已有大量研究指出NLRP3炎症小体的活化是AMI过程中炎症反应发生的导火索。AMI再灌注时心肌细胞内NLRP3炎症小体识别危险信号进而活化,活化的炎症小体诱导以巨噬细胞为代表的免疫细胞释放出炎症因子IL-1 β和IL-18。IL-1 β可以进一步激活IL-6、COX-2、TNF-α、PLD和核转录因子-kappaB(NF-κB)等炎性细胞因子和趋化因子,促进炎症反应的发生发展。另一方面,炎症反应导致内皮细胞渗漏和血脑屏障完整性破坏,NLRP3活化后下游释放的前炎症因子如IL-6、TNF-α释放入血,透过受损的血脑屏障进入脑内,一些神经毒性物质亦可通过血脑屏障破坏正常的脑功能,诱导脑内细胞凋亡,从而引发抑郁的产生。人体和动物实验证实NLRP3炎症小体在抑郁的发生发展中也起着重要作用,抑制NLRP3炎症小体的活化可减轻抑郁的发生和慢性压力导致的抑郁行为。因此可见,NLRP3介导炎症反应是AMI和抑郁症共同的发病机制,从该角度探索心梗后抑郁的发生机制有一定的理论依据。既往研究指出omega-3脂肪酸可能参与影响NLRP3炎症小体的激活过程。omega-3脂肪酸具有抗炎、稳定内皮的功能。2013年发表于Immunity杂志的研究结果显示,omega-3脂肪酸通过与细胞膜表面的G蛋白偶联受体120(GPR120)和GPR40结合,后者再与下游的β-2抑制蛋白(β-arrestin 2,ARRB2)结合来抑制NLRP3炎症小体的活化,同时也指出omega-3脂肪酸在代谢前即参与NLRP3炎症小体活化的调节。Kim等发现omega-3脂肪酸可通过抑制iNOS通道的激活和NMDA受体的活性减轻福尔马林导致的炎症性疼痛。此外,新近研究也表明omega-3脂肪酸可以通过调节P2X7R/NLRP3炎症小体轴发挥保护炎症性抑郁和免疫调节的作用。上述发表于Immunity杂志的研究也指出DHA-GPR120/40-NLRP3炎症小体之间除了 NRRB2通路外,仍存在其它通路。已有研究证实omega-3脂肪酸可以通过PI3K/AKT通路降低炎症反应进而改善糖尿病大鼠的听力以及狼疮肾小鼠肾脏功能。课题组既往研究利用fat-1转基因小鼠心梗组织KEGG分析发现PI3K/AKT信号通路和mTOR信号通路被抑制提示omega-3脂肪酸可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥抗炎活性。然而,有研究表明omega-3脂肪酸和藻油的复合油类物质可以激活PI3K/Akt途径抑制衰老引起的内皮功能障碍和血管胰岛素抵抗。此外,omega-3脂肪酸被认为可以通过激活PI3K/Akt/β-catenin信号通路降低新生儿缺氧/缺血损伤后的脑损伤并改善神经功能。此外,新近研究也发现omega-3脂肪酸的分解代谢产物Resolvin D1(RvDl)通过激活PI3K/Akt通道降低缺血再灌注时的心肌梗死面积,且该心脏保护作用可被PI3K/Akt抑制剂完全消除。由此可见PI3K/Akt/mTOR信号通路可能介导omega-3脂肪酸对心梗后抑郁的作用。总而言之,心梗后抑郁的发生导致心脏功能下降及心脏性猝死的发生。然而,现有抗抑郁药仅能改善其临床抑郁症状,并不能改善心梗患者的预后。为了解决这一临床难题,为临床心梗后抑郁患者的营养学干预和相应药物开发提供理论依据。本课题组前期研究发现fat-1小鼠心脏组织高表达omega-3脂肪酸。故本研究拟利用fat-1小鼠和同窝出生的WT小鼠建立小鼠心梗后抑郁模型,模仿临床上心肌梗死后抑郁的发病特点,研究omega-3脂肪酸是否能够影响心梗后抑郁的发生发展及omega-3脂肪酸、NLRP3炎症小体和PI3K/Akt/mTOR信号通路之间的关系,验证omega-3脂肪酸通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制NLRP3炎症小体活化保护心梗后抑郁这一假说。通过本研究,可为心梗后抑郁患者的营养学干预和相应药物的开发提供理论依据。第一章Omega-3脂肪酸对心梗后抑郁小鼠的保护作用目的:1.观察fat-1小鼠和WT小鼠心梗后抑郁造模后的心脏功能变化和行为学的改变.2.探讨omega-3脂肪酸对心梗后抑郁的保护作用及机制。方法:1.鼠尾DNA鉴定fat-1转基因小鼠。2.术前利用蔗糖水试验、旷场和强迫游泳试验等行为学测试方法评估各组小鼠的行为学状态。3.利用fat-1小鼠和同窝出生的WT小鼠建立小鼠心梗后抑郁模型。每组分成4个亚组:假手术组、心梗组、抑郁组、心梗后抑郁组。通过结扎心脏冠脉前降支构建小鼠心梗模型及慢性温和不可预见性应激方法(chronic unpredictable mild stress,CUMS)建立抑郁模型。造模2周后用心脏彩超、心脏组织HE染色和masson染色等实验方法证实小鼠心肌梗死模型造模成功。4.小鼠心梗造模后造模后第15天进行蔗糖水实验、旷场和强迫游泳试验评价小鼠行为学改变,如达到抑郁标准者归为心梗后抑郁组,未达到标准者归为心梗组。至此,心梗后抑郁模型建立成功。5.ELISA检测方法测定小鼠血清单胺类神经递质5-HT的表达水平。结果:1.实验小鼠鼠尾DNA基因型鉴定:fat-1转基因小鼠的琼脂糖凝胶电泳结果中存在100 bp条带,而WT小鼠100bp位置不存在此条带。2.术后小鼠的基本情况:假手术组和抑郁组术后均无小鼠死亡。WT小鼠的存活率为63.3%(19/30),而fat-1小鼠的存活率为70.0%(21/30),其中WT小鼠心梗术后出现抑郁的比例是63.2%(12/19),fat-1小鼠心梗术后出现抑郁的比例是28.6%(6/21),两者的差异具有统计学意义(p=0.028)。3.心脏彩超结果:fat-1转基因小鼠和WT小鼠心梗术2周后心脏收缩功能均明显降低,左室舒张末内径和左室收缩末内径明显增大,提示心肌梗死造模成功。与WT心梗后抑郁组相比,fat-1心梗后抑郁小鼠左室EF值和收缩功能的下降程度明显得到改善。4.HE染色结果:正常心肌细胞HE染色排列整齐,肌丝和纤维走向明晰,细胞核大小均一,染色正常。而心梗造模后的小鼠心肌梗死区HE染色心肌细胞排列不齐,核的大小也不规则,同时还伴有大量的坏死细胞和炎症细胞。5.Masson染色:可以看到心梗造模小鼠的心脏出现呈片状分布的胶原纤维及大范围胶原纤维沉积的瘢痕。与WT心梗后抑郁组相比,fat-1心梗后抑郁小鼠心室重塑程度明显减轻,心脏纤维化面积更小。6.行为学测试结果:造模前8组小鼠没有明显差异。造模后与假手术组相比,抑郁组和心梗后抑郁组小鼠蔗糖水试验的糖水偏爱度明显下降,强迫游泳试验的不动时间明显延长,旷场试验的总运动距离明显减小,说明心梗后抑郁组小鼠出现了抑郁症状。7.血清5-HT结果:造模后与假手术组和心梗组相比,抑郁组和心梗后抑郁组小鼠血清5-HT水平明显下降。与WT心梗后抑郁组相比,fat-1心梗后抑郁小鼠血清5-HT表达明显上调。结论:Omega-3脂肪酸不仅可以保护心梗后抑郁小鼠的心脏功能,也能改善其抑郁类症状。第二章Omega-3脂肪酸抑制NLRP3小体活化保护心梗后抑郁小鼠目的:1.观察fat-1转基因小鼠和WT小鼠心梗后抑郁造模后NLRP3小体的活化程度改变和血清NLRP3炎症小体下游炎症因子的表达变化。2.探讨omega-3脂肪酸是否影响NLRP3小体的活化继而对心梗后抑郁发挥保护作用。方法:1.RT-qPCR方法检测小鼠心肌NLRP3小体组分NLRP3、Caspase-1和IL-1β的mRNA表达水平。2.Western blot方法检测小鼠心肌NLRP3、Caspase-1和IL-18的蛋白表达水平。3.免疫组化染色方法检测心肌NLRP3的蛋白表达水平。4.ELISA方法检测NLRP3小体下游代表性炎症因子IL-1β、IL-18和TNF-α的表达水平。结果:1.RT-qPCR结果显示:与WT假手术组相比,WT抑郁组、WT心梗组和WT心梗后抑郁组NLRP3、Caspase-1和IL-1β的mRNA表达明显上调,提示心梗后抑郁NLRP3炎症小体活化,其中WT心梗后抑郁组是活化程度最高的。与WT心梗后抑郁组相比,fat-1心梗后抑郁组的NLRP3、Caspase-1和IL-1β的mRNA表达则显著下调。2.Western blot结果显示:与WT假手术组相比,WT抑郁组、WT心梗组和WT心梗后抑郁组NLRP3、Caspase-1和IL-18的蛋白表达均明显上调,WT心梗后抑郁组表达水平最高,提示心梗后抑郁NLRP3炎症小体活化,其中WT心梗后抑郁组是活化程度最高的。而与WT心梗后抑郁组相比,fat-1心梗后抑郁组的NLRP3、Caspase-1和IL-18的蛋白水平均显著下调。3.免疫组化染色结果显示:与WT假手术组相比,WT抑郁组、WT心梗组和WT心梗后抑郁组NLRP3蛋白表达明显上调,WT心梗后抑郁组表达水平最高。与WT心梗后抑郁组相比,fat-1心梗后抑郁组的NLRP3蛋白水平显著下调。4.ELISA结果显示:与WT假手术组相比,WT抑郁组、WT心梗组和WT心梗后抑郁组血清IL-1β、IL-18和TNF-α的表达均明显上调,其中WT心梗后抑郁组表达水平最高。而与WT心梗后抑郁组相比,fat-1心梗后抑郁组血清IL-1β、IL-18和TNF-α的表达均显著下调。结论:Omega-3脂肪酸可通过抑制NLRP3炎症小体的活化继而对心梗后抑郁发挥保护作用。第三章Omega-3脂肪酸通过激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制NLRP3炎症小体活化目的:1.观察fat-1转基因小鼠和WT小鼠心梗后抑郁造模后PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白的表达变化.2.探讨omega-3脂肪酸是否通过PI3K/Akt/mTOR信号通道抑制NLRP3小体的活化继而对心梗后抑郁产生保护作用。方法:Western blot方法检测了小鼠心肌PI3K/Akt/mTOR通路关键蛋白的表达水平。结果:Western blot结果显示:与假手术组相比,WT抑郁组、WT心梗组和WT心梗后抑郁组的Akt磷酸化水平、PI3K蛋白表达和mTOR磷酸化水平均明显下调,WT心梗后抑郁组则为三组中表达最低的。而与WT心梗后抑郁组小鼠相比,fat-1心梗后抑郁组小鼠的Akt磷酸化水平、PI3K蛋白表达和mTOR磷酸化水平明显上调。结论:omega-3脂肪酸通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通道抑制NLRP3炎症小体的活化继而发挥对心梗后抑郁的保护作用。全文总结:Omega-3脂肪酸通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通道,进而抑制NLRP3炎症小体的活化和下游炎症因子的表达,从而提高了心梗后抑郁小鼠的心脏功能,也改善了小鼠的抑郁样症状,发挥对心梗后抑郁的保护作用。