论文部分内容阅读
鸭疫里默氏菌病是危害水禽养殖业的重要细菌性传染病之一。生产实践中,鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer,RA）的广泛耐药给该病的有效防治带来很大困难。为了解RA的耐药机制,本研究在对RA分离株进行耐药表型及耐药基因检测的基础上,对RA耐药基因簇及其功能进行研究,主要结果如下:一、鸭疫里默氏菌分离株耐药表型及耐药基因的检测、新耐药基因功能验证论文首先对108株来自不同地区的RA分离株进行药敏试验及PCR检测耐药基因,同时对新检出的tet（A）、tet（M）、tet（O）和tet（Q）通过转化ATCC 11845株进行功能验证。药敏试验结果显示,RA对四环素、红霉素、林可霉素、头孢噻呋、氨曲南和磺胺甲噁唑等6类抗生素耐药严重,耐药率分别为94.4%、90.7%、92.6%、43.5%、81.5%和100%。耐药基因检出率高,尤其是tet（X）、erm（F）和bla-1基因,检出率分别为90.7%、77.8%和83.3%。除tet（B）、tet（C）、tet（E）、tet（G）、tet（K）、tet（W）和tet（O/W/32/O）等基因未检测到,其余耐药基因均不同程度被检出,其中包括在RA中未被报道过的tet（A）、tet（M）、tet（O）和tet（Q）等四环素耐药基因。tet基因转化接合子表现为四环素耐药,MIC值范围为4-64μg/m L。二、RA多耐药基因簇分析及其功能活性的验证本章对RA-CH-1、RA-CH-2及ATCC 11845进行耐药表型测定及比较基因组学分析。同时对RA-CH-2株耐药基因簇进行生物信息学分析、功能活性及转移性验证。结果显示,RA-CH-1和RA-CH-2株较ATCC 11845耐药严重,且在RA-CH-1和RA-CH-2株基因组有多个耐药基因成簇存在,且与其耐药表型相对应。生物信息学分析结果表明RA-CH-2菌株多耐药基因簇为:tet（X）-lnu（H）-bla-1-aads-cat-ere（D）-dhfr-cat-bla-2-tet（X）。通过耐药基因簇的缺失及表型测定,初步确认了该耐药基因簇的功能。自然转化试验证实,多耐药基因簇内除bla-1和bla-2外的其它耐药基因均可发生自然转移,甚至整个耐药基因簇也可发生转移。三、林可胺核苷酰基转移酶基因lnu（H）的功能研究本章对RA-CH-2株的G148＿1775基因进行生物信息学分析、基因缺失、蛋白表达及纯化、酶活测定、酶灭活产物质谱分析和基因流行率及转移性调查。结果显示,G148＿1775蛋白与其他已报道的林可胺核苷酰基转移酶的相似性小于41%,为新的林可胺耐药基因lnu（H）。RA-CH-2株、lnu（H）基因表达菌株及回补株表现为高浓度林可胺类抗生素耐药,而lnu（H）基因缺失株林可霉素和克林霉素MIC分别下降512和32倍。酶活测定及质谱分析证实,Lnu（H）蛋白能够核苷酰化林可霉素和克林霉素。该基因自然转化率约为10-7,在分离株中的流行率为38%。四、红霉素酯酶基因ere（D）的功能研究本章对RA-CH-2株的G148＿1771基因进行生物信息学分析、基因缺失、蛋白表达、酶活测定、基因流行率及转移性调查。结果显示,G148＿1771属于D类红霉素酯酶基因,命名为ere（D）。RA-CH-2株和ere（D）基因表达菌株表现为红霉素耐药,而ere（D）基因缺失株则表现为敏感（MIC值为0.25?g/m L）。酶促分解4-硝基苯丁酸酯试验证实Ere（D）具有低效率酶活性,催化效率为34.0 L mol-1s-1。该基因自然转化率约为10-7,在分离株中的流行率为28.7%。五、四环素灭活酶基因tet（X）的功能研究本章对RA-CH-2株的G148＿1767和G148＿1777基因进行生物信息学分析、基因缺失、蛋白表达、酶活测定、实时荧光定量PCR（q RT-PCR）、基因流行率及转移性调查。结果显示,G148＿1767和G148＿1777基因为100%相似的双拷贝tet（X）基因。RA-CH-2株、G148＿1767基因缺失株及回补株表现为四环素类耐药,而G148＿1777基因缺失株及双缺失株均表现为敏感。酶活测定显示,Tet（X）蛋白能够灭活四环素类抗生素。q RT-PCR分析发现,tet（X）基因的表达受到四环素诱导浓度的影响,浓度为8?g/m L时tet（X）基因表达量最大;G148＿1767基因缺失时不影响tet（X）基因的表达,而G148＿1777缺失时,该基因的表达量显著下降（至少10倍）。该基因自然转化率约为10-6,在分离株中的的流行率为90.7%。六、β-内酰胺酶基因的功能研究本章对RA-CH-2株G148＿1768和G148＿1774基因、RCAD0122株AWB56＿10175和AWB56＿01405基因进行生物信息学分析、基因缺失、蛋白表达、酶活测定、基因流行率及转移性调查。结果显示,G148＿1774和AWB56＿10175基因100%相似,和AWB56＿01405同为新的A类β-内酰胺酶基因,暂指定为bla-1和bla RAA-1;G148＿1768为D类β-内酰胺酶基因,暂指定为bla-2。在RA-CH-2株中,无论bla-1还是bla-2基因缺失时,β-内酰胺类抗生抗性无变化会变化轻微;只有当bla-1还是bla-2双基因缺失时,菌株才会表现为对所有β-内酰胺类抗生素敏感。在RCAD0122株中,当缺失bla-1基因时,菌株的β-内酰胺类抗生素耐药性未发生变化;而当缺失bla RAA-1基因时,菌株表现为β-内酰胺类抗生素敏感。同时bla-1和bla RAA-1基因的克隆菌株及表达菌株均表现为高浓度β-内酰胺类抗生素耐药,且所有测试菌株均表现为典型的抗生素与抑制剂间协同作用。酶活测定结果显示,G148＿1774和RAA-1蛋白具有灭活β-内酰胺类抗生素活性。bla-1和bla-2基因均不具有自然转移活性,bla RAA-1基因自然转化率约为10-7。综上,本研究发现RA多耐药现象严重,多重耐药基因簇广泛存在。同时鉴定了lnu（H）、ere（D）、tet（X）、bla-1、bla-2、bla RAA-1、tet（A）、tet（M）、tet（O）和tet（Q）等耐药基因的功能,有助于系统的阐明RA耐药的分子机制,为生产中合理用药提供科学依据。尤其是耐药新基因lnu（H）、bla-1和bla RAA-1的发现具有重要的科学意义。