拟态弧菌(Vibrio mimicus，Vm)是一种广宿主病原菌，可感染各种水产养殖动物引起腹水病，严重威胁我国水产养殖业的健康发展。细菌黏附是病原菌引发感染的关键起始步骤，其实质是细菌黏附素与宿主受体之间相互作用，使病原菌选择性地定植于宿主细胞表面，继而生长繁殖，产生毒力因子或侵入深部，损伤组织细胞，导致疾病的发生。从分子水平探明特定病原菌的黏附素及其关键功能域，设计和创制基于关键功能域的新型黏附拮抗剂，是目前细菌性疾病防治的新策略。我们的前期研究结果表明：拟态弧菌外膜蛋白U（OmpU）是一种较为保守的抗原蛋白，具有6个免疫优势B细胞线性表位，该蛋白N末端含有黏附素基序，抗OmpU抗体可抑制细菌对人源上皮细胞的黏附,推测OmpU可能是拟态弧菌的黏附素。从前述重要的实验现象出发，本研究以鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma Papulosum Cyprinid, EPC)作为细胞黏附模型，建立检测细菌或蛋白黏附特性的技术平台，确证OmpU蛋白的黏附功能，深入解析其受体关键结合域，从而为创制新型黏附拮抗剂提供理论支持。主要研究内容包括：　　1、拟态弧菌的黏附特性测定　　以EPC细胞作为细胞黏附模型，建立检测细菌或蛋白黏附的技术平台，研究拟态弧菌的黏附特性。结果显示拟态弧菌04-14菌株可聚集性地黏附于EPC细胞周围，其最佳感染复数（MOI）为60，最佳黏附温度是28℃，最佳黏附时间为60min。胰酶、蛋白酶K、半乳糖可完全阻断04-14菌株对EPC细胞的黏附，乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖和麦芽糖对细菌的黏附活性无影响。结果表明拟态弧菌的黏附素为蛋白质，与该黏附素相结合的受体结构中存在寡糖链，其中半乳糖残基决定其特异性。　　2、OmpU基因荧光原核表达质粒的构建与表达　　应用基因重组技术构建荧光原核表达质粒pET-32a-EGFP-OmpU，转化至E.coli Rosetta进行大量诱导表达，继而使用Ni-Charged Resin亲合层析柱纯化重组发光蛋白EGFP-OmpU。经SDS-PAGE分析和荧光鉴定，发现纯化后重组发光蛋白EGFP-OmpU的浓度为1.4mg/mL，纯度达到90％，在488 nm激发光下可稳定发出亮绿色荧光。该重组发光蛋白可作为后续黏附功能鉴定的试验材料。　　3、OmpU蛋白的黏附功能鉴定　　以EPC细胞为细胞黏附模型，兔抗OmpU纯化抗体为一抗，FITC标记山羊抗兔IgG为二抗，DAPI为细胞核荧光染料，采用间接免疫荧光法鉴定OmpU蛋白的黏附功能。经倒置荧光显微镜观察可见rOmpU与EPC细胞孵育后，细胞表面出现明显的绿色荧光点，细胞核呈现蓝色荧光；而只加细胞培养液或荧光标记抗体的对照细胞表面未见到荧光，只有细胞核发出蓝色荧光。研究中同时进行了抗rOmpU抗体黏附抑制试验，以及重组发光蛋白EGFP-OmpU与rOmpU的黏附竞争试验，结果显示抗rOmpU抗体具有黏附抑制作用；rEGFP-OmpU与EPC细胞孵育后，细胞表面出现明显的绿色荧光点，而rEGFP-OmpU与rOmpU共同与细胞孵育时，细胞表面荧光明显减弱。这些结果均证实rOmpU蛋白具有黏附功能。　　4、OmpU蛋白受体结合域的确定　　人工合成OmpU蛋白的6个免疫优势B细胞线性表位肽并于 N端标记异硫氰酸荧光素( FITC)，采用流式细胞术分析不同表位肽与EPC细胞的结合特性，以及标记表位肽与未标记表位肽对EPC细胞的竞争结合性。结果显示6条FITC-表位肽与EPC细胞孵育后，荧光标记阳性细胞数百分比分别为5.51%、99.60%、3.93%、98.30%、6.35%和13.10%，对应的平均荧光强度（MFI）分别为18±0.42、650±11.93、16±0.37、571±10.95、19±0.51和27±0.63。其中Epitope peptide90-101和Epitope peptide173-192试验组的荧光标记阳性细胞数和MFI明显高于对照组(p<0.01)，并且可以被相应过量的未标记表位肽所抑制。结果表明这两条表位肽具有与EPC细胞特异性结合能力，OmpU黏附素蛋白N端90~101和173~192氨基酸区域为其受体关键结合域的线性部位，可作为新型黏附拮抗剂的有效靶位。　　综上所述，本研究首次确证了拟态弧菌OmpU蛋白的黏附功能，确定其N端90~101和173~192氨基酸区域为其受体关键结合域的线性部位。研究结果为创制新型黏附拮抗剂奠定了良好基础。