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猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度接触性传染病,是危害养猪业的重大传染病之一。自发现以来已流行于世界上多个国家,我国更是深受CSFV侵害的国家之一。目前在中国流行的CSFV毒株与之前的流行株相比,在遗传变异、毒力和致病性等方面都已发生了较大改变,这也使得我国对CSFV的防治面临更严峻的挑战。为了更好的预防与控制CSF,针对CSFV的致病机制,毒力的决定因素等问题仍需进行更深入的探究。随着实验研究的深入和相关学科的发展,反向遗传学技术已经成为研究RNA病毒的重要手段,在CSFV的研究中也发挥着越来越重要的作用。通过构建高效经济的CSFV反向遗传操作系统可以从基因水平上对CSFV有更深入的研究,也可以为CSFV的传统研究提供更多的思路。本研究基于DNA-Launched反向遗传技术,采用RNA聚合酶Ⅱ系统,分别构建了含有CSFV兔化弱毒疫苗株及强毒石门株全长基因组序列的感染性克隆。通过在CSFV基因组的5’端引入巨细胞病毒(CMV)启动子,3’端引入丁型肝炎病毒(HDV)核酶以及牛生长激素(BGH)信号序列等必要的工程核酶原件,然后将病毒基因组分段克隆进低拷贝的细菌人工染色体(BAC)载体中,可以使CSFV基因组在宿主细胞内正确复制翻译并且提高病毒的拯救效率。区别于传统的体外转录或构建细胞系的方法,本研究构建的感染性克隆转染PK-15细胞后,在细胞内完成转录,可快速、有效的直接收获拯救病毒。成功收获两种毒株的拯救病毒之后,分别对其进行遗传标记的鉴定与生物学特性的验证试验。试验结果说明拯救的病毒与其亲本毒株具有相似的生物学特性,引入的遗传标记经过验证可以对其进行有效的区分,同时拯救获得的病毒在体外细胞上也有着良好的增殖能力,可以用于CSFV后续的反向遗传学研究。在此基础上,通过反向遗传技术将外源基因EGFP引入CSFV兔化弱毒疫苗株的感染性克隆,成功构建了含有EGFP基因的重组CSFV兔化弱毒疫苗株全长cDNA克隆,并尝试进行重组病毒的拯救,以期获得能够稳定传代并表达EGFP荧光标记的重组CSFV兔化弱毒疫苗株,使CSFV的检测实现可视化。荧光显微镜观察结果显示,P1、P2代可见微弱绿色荧光,但在其后的传代中,荧光逐渐消失,推测由于蛋白构象发生了改变,影响了基因的正常功能,导致EGFP无法在CSFV基因组中稳定表达并传代。综上,本研究通过反向遗传操作技术,成功构建了我国CSFV兔化弱毒疫苗株和强毒石门株的感染性克隆,并能够快速、有效的收获拯救病毒。在此基础上,构建了含有EGFP基因的重组CSFV兔化弱毒疫苗株全长cDNA克隆。为下一步对CSFV致病机制的探究以及猪瘟标记疫苗的研究打下了基础。