二氯喹啉酸、苄嘧磺隆及其复配制剂的微生物毒理和降解研究

来源 :浙江大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yuhang0211
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本文主要分为二氯喹啉酸、苄嘧磺隆及两者的复配制剂对细菌纯培养的毒理研究和二氯喹啉酸苄嘧磺隆复合污染微生物降解研究两个部分,分述如下:1.以二氯喹啉酸高效降解菌株Stenotrophomonas.maltophilia WZ2和典型阴性对照菌株大肠杆菌K12为实验材料,通过详细描述这两种细菌在除草剂二氯喹啉酸、苄嘧磺隆及两者的复配制剂存在下的生长、抗氧化酶活性、应激反应的变化,研究了这三种除草剂胁迫对微生物纯培养的生理毒性,获得如下初步结论:在本实验范围内,不同浓度的二氯喹啉酸、苄嘧磺隆及其复配制剂分别不同程度地诱导了处于指数生长期细菌的SOD比活力,但没有明显诱导CAT活力。而对于处于稳定生长期的细菌,除草剂二氯喹啉酸或苄嘧磺隆的加入均刺激了S.maltophilia WZ2 SOD和CAT活力的升高,但E.coli K12的CAT水平没有明显变化。相比之下,二氯喹啉酸是较苄嘧磺隆敏感的SOD酶合成诱导因子,而苄嘧磺隆是较二氯喹啉酸敏感的CAT酶合成诱导因子。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及活性染色结果显示二氯喹啉酸和苄嘧磺隆诱导增加了S.maltophilia WZ2 Mn-SOD的表达并新诱导了两种过氧化氢同工酶的产生,而且coli K12没有新类型的SOD或CAT被诱导出来,说明一种特定的细菌可能通过增加某种固有同功酶的表达,也可能诱导附加同功酶的表达来应对突然升高的氧化压力。通过这两种细菌抗氧化特征的研究可见,对于除草剂二氯喹啉酸、苄嘧磺隆及其复配制剂引发的氧化压力,细菌SOD酶发挥了关键性的作用而CAT酶的抗氧化作用则是有限的。2.从农药厂长期受除草剂污染土壤中分离筛选到一株可同时降解二氯喹啉酸及苄嘧磺隆的菌株LS。经形态学、生理生化特征(常规实验、Vitek微生物鉴定系统及Biolog微平板鉴定系统)、16S rDNA序列测定和系统发育分析表明,LS菌株属于苍白杆菌属(Ochrobactrum),命名为Ochrobactrum sp.LS,各项指标与人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)相当接近。但是,据报道人苍白杆菌生有周生鞭毛,此与本实验结果(电镜观察和鞭毛染色实验)不一致。LS菌株降解特性研究表明,菌株LS对单一除草剂二氯喹啉酸、苄嘧磺隆的最终降解率分别为90%、67%,对复配制剂二氯·苄中二氯喹啉酸和苄嘧磺隆的最终降解率分别为95.2%和67.5%。从菌株LS的生长情况和除草剂降解之间的线性相关性上来讲,LS生长与单剂除草剂的利用之间存在较好的相关性(二氯喹啉酸:相关系数R=0.9859;苄嘧磺隆:R=0.9471),而当复配除草剂为唯一碳源时,LS生长与二氯喹啉酸、苄嘧磺隆的降解线性相关性都较单剂时差(二氯喹啉酸:R=0.9123;苄嘧磺隆:R=0.7869)。菌株LS经二氯喹啉酸、苄嘧磺隆及两者的复配制剂诱导后SDS-PAGE图谱显示出明显的特异性条带,极可能是与二氯喹啉酸、苄嘧磺隆降解有关的酶蛋白。此外,底物降解试验说明菌株LS还能利用苯酚、对苯二酚、邻苯二酚及苯甲酸;能缓慢利用除草剂异丙草胺、二甲四氯钠、咪草烟及杀菌剂三环唑。抗生素试验表明菌株LS对头孢菌素(960μg·mL-1)、先锋霉素(960μg·mL-1)、克林霉素(480μg·mL-1)、氨苄青霉素(1200μg·mL-1)及青霉素钠(640μg·mL-1)都具有抗性,而对丁胺卡那霉素(80μg·mL-1)、乳酸糖红霉素(240μg·mL-1)、硫酸庆大霉素(60μg·mL-1)和氯霉素(240μg·mL-1)表现敏感,出现抑菌圈。菌株LS的最适生长温度为37℃,4℃有略微生长,45℃时不能生长。在pH6~9范围内菌株的生长情况相差无几,在pH10时生长较差些;菌株对二氯喹啉酸的最佳降解pH为7,对苄嘧磺隆的最佳降解pH为8。5种微量元素最有利于菌株LS生长的添加浓度分别为:0.00625g·L-1Mn离子、0.005g·L-1Zn离子、0.003 g·L-1Fe离子、0.001 g·L-1Co离子和0.01 g·L-1Ca离子;当添加的Mn离子浓度≥0.05 g·L-1、Zn离子浓度≥0.01 g·L-1、Fe离子浓度≥0.006 g·L-1、Co离子浓度≥0.002 g·L-1时,菌株LS的生长受抑制;5种微量元素对菌株LS生长影响大小(F值或显著水平)排列顺序为:Mn>Zn>Co>Ca>Fe。一定量酵母膏的加入一方面加速了菌株LS的生长,另一方面使得菌株LS对二氯喹啉酸和苄嘧磺隆的降解更加完全。在无机盐培养基中随着添加的二氯·苄复配制剂浓度的升高菌株LS生长量也随之增加,当二氯·苄复配制剂添加量为1500 mg/L时其生长情况最好。
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