卵泡膜细胞（theca cells,TC）在雌激素合成和卵巢细胞分化发育过程中具有重要作用。研究证实,TC由卵巢中的卵泡膜干细胞（theca stem cells）分化而来。目前,已从人、小鼠、绵羊、猪等多种脊椎动物中分离鉴定了卵泡膜干细胞,并发现其能够被诱导分化为产生性类固醇激素如雄烯二酮、睾酮、雌激素的成熟TC。然而,鱼类卵泡膜干细胞相关研究,目前未见报道。另一方面,CRISPR/Cas9技术已被成功应用于哺乳类体外培养细胞的基因编辑,但该技术在鱼类体外培养细胞中,尚不成熟,亟待进一步研究。鉴于此,本研究以罗非鱼（本研究中如没有特殊说明,均指尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus））为研究材料,开展了如下两方面的工作:一是建立罗非鱼卵泡膜干细胞系,并对其进行体内外鉴定;二是建立鱼类体外培养细胞CRISPR/Cas9基因编辑技术体系。具体如下:1罗非鱼卵泡膜干细胞系的建立1.1卵巢细胞培养及初步鉴定取3月龄健康罗非鱼卵巢,经分离、传代及克隆化生长,最终获得了能稳定生长的细胞系,目前已传至第60代共184天。该细胞系形态呈梭形或者不规则的多边形;碱性磷酸酶染色为强阳性;核型分析显示60%以上为二倍体,表明该细胞系核型正常,没有异倍体化;RT-PCR检测生殖细胞及卵巢体细胞相关基因如dnd、vasa、cyp19a1a、fshr、sf1的表达,结果均未见阳性信号。提示,该细胞系可能为卵巢干细胞。1.2不同培养条件对细胞增殖活性的影响MTS检测不同浓度胎牛血清（FBS）及其他不同因子对细胞增殖的影响。结果显示,不同浓度FBS对细胞增殖具有显著促进作用,并且具有浓度依赖,其中15%FBS的促增殖作用最强;人碱性成纤维生长因子、罗非鱼白血病抑制因子、青鳉胶质细胞源神经营养因子a/b、罗非鱼胚胎提取物和Smoothened激动剂（SAG）显著促进细胞增殖,而罗非鱼卵巢提取物（TOE）、Stat3抑制剂、Smoothened拮抗剂环巴胺和视黄酸显著抑制细胞增殖。1.3体外诱导分化用含有TOE和/或SAG的分化培养基对第25代卵巢细胞进行诱导分化,通过RT-PCR、免疫组化检测性类固醇合成相关酶和蛋白相关基因的表达、酶联免疫检测培养上清雌二醇水平及油红O染色检测细胞中油滴的形成,以探究细胞的体外分化潜能。RT-PCR结果显示,不同的分化培养基均可诱导细胞促黄体生成素受体（lhr）及性类固醇合成相关蛋白与酶类如star2、3β-hsd、cyp17a1和cyp19a1a的表达,不表达卵泡刺激素受体（fshr）;同时免疫荧光检测到Star2、Cyp17a1和Cyp19a1a蛋白的表达;在诱导21天,含SAG或同时含有SAG与TOE的分化培养基均可显著促进细胞雌二醇的合成;油红O染色结果显示,诱导28天后细胞中有明显染成红色或淡红的油滴,而对照组未见此现象。从而表明,培养的卵巢细胞可被最终诱导分化为性类固醇激素合成细胞,并且SAG是促进其分化的关键分子。由于在诱导分化前后细胞均不表达fshr,结合细胞表达的相关标记分子及哺乳类相关文献报道,我们初步鉴定该细胞为卵泡膜干细胞,命名为TTS（tilapia theca stem cells）。1.4体内细胞移植活细胞荧光染料PKH26（红色）标记的TTS经生殖孔显微注射到6月龄罗非鱼卵巢,以检测TTS的体内分化潜能。移植后14天,荧光显微观察,可见供体细胞成功定植于卵巢间质及卵泡膜层,免疫组化结果显示,移植的TTS表达Star2和Cyp19a1a,但未见生殖细胞标志分子Vasa的表达,从而表明,TTS同样具有体内分化潜能。该结果进一步证实,TTS为卵泡膜干细胞系。2鱼类体外培养细胞CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立2.1 sgRNA和Cas9共表达载体的改建及其表达与哺乳类sgRNA和Cas9共表达载体不同,商业化载体pcl2EGFPpz U6sgRNA[EGFP]-p CVz Cas9的sgRNA为由斑马鱼U6启动子驱动EGFP位点特异靶序列,Cas9编码序列基于斑马鱼基因组进行了优化。为敲除细胞筛选需要,我们将该载体pcl2EGFP元件替换为p SV40Neo元件,将该载体改建为可进行药物筛选的sgRNA和Cas9共表达载体,命名为p SV40Neo-pz U6sgRNA[EGFP]-p CVz Cas9。将改建载体转染青鳉精原干细胞（SG3）、青鳉胚胎干细胞（MES1）、罗非鱼胚胎干细胞（TES6）、罗非鱼Leydig干细胞（TSL）和TTS,24 h后RT-PCR检测到sgRNA[EGFP]和z Cas9 m RNA在上述鱼类不同细胞中均有表达。2.2培养细胞报告基因EGFP的敲除以转染绿色荧光报告蛋白EGFP的TTS为模型,探究改建载体可否应用于鱼类体外培养细胞基因编辑。用强启动子CMV驱动EGFP的pcvpf2载体与改建载体共转染细胞,24 h后观察细胞的绿色荧光信号强弱。结果显示,细胞绿色荧光信号强度与转染的改建载体剂量成明显负相关,即转染剂量越大,荧光信号强度越弱。从而表明,改建载体对TTS中转染的EGFP可进行有效基因编辑。2.3目的基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建分别设计、合成罗非鱼sf1、dazl的sgRNA,通过胚胎显微注射检测其工作效率,进一步将工作效率良好的靶序列成功构建到上述改建载体中,分别命名为p SV40Neo-pz U6sgRNA[sf1]-p CVz Cas9与p SV40Neo-pz U6sgRNA[dazl]-p CVz Cas9。2.4 Onsf1打靶载体的构建构建了Onsf1打靶载体,以进一步建立TTS细胞sf1的敲除报告细胞系。以pcvpf2载体中CMV启动子驱动筛选基因嘌呤霉素（pac）融合报告基因EGFP编码序列的表达盒（CMV-pac EGFP）为骨架,在CMV元件上游插入序列长度为1174bp的Onsf1靶位点左侧同源序列（Onsf1LHA）,下游插入序列长度为1466 bp的Onsf1靶位点右侧同源序列（Onsf1RHA）,载体命名为pcvpf2-Onsf1HA。综上所述,本研究成功建立了罗非鱼卵泡膜干细胞系TTS,并初步建立了鱼类体外培养细胞的CRISPR/Cas9基因编辑技术体系。该研究不仅为卵泡生成及鱼类基因功能研究提供了极好研究模型与手段,而且可为由卵泡膜细胞发育障碍引起的卵巢相关疾病治疗提供参考。