猪链球菌(Streptococus suis)是一种重要的病原菌,它可导致猪或人产生脑膜炎、败血症、关节炎等。猪链球菌已导致数百人死亡和数万头生猪死亡或淘汰。目前,主要有两种防治猪链球菌病的方法:疫苗免疫和抗生素治疗。疫苗能有效地预防但不能治疗猪链球菌病,且猪链球菌众多的血清型会影响其免疫效果。抗生素是目前治疗猪链球菌病的主要药物,但其易产生耐药性菌,使其治疗效果受到威胁。因此,寻找新的防治猪链球菌病的策略或手段意义重大。近年来,人们提出了一种非常有前景的防治策略一抗黏附疗法,即使用药剂尤其是糖类化合物抑制病原菌黏附到宿主细胞。黏附是病原菌定植宿主的首要和必要的步骤,并且许多病原菌都是通过其表面的糖蛋白结合宿主细胞表面的受体寡糖实现这一黏附过程。与单体寡糖相比,将受体寡糖连接到高分子载体上所形成的多价抑制剂和病原菌黏附素间的亲和力可提升几个数量级,因此,设计、合成多价黏附抑制剂已成为抗菌药物研发的一个重要方面。　　 自1993年猪链球菌的受体寡糖-galabiose(Galα1-4Gal)(图10,Page14)被鉴定后,国际上已有一些关于猪链球菌多价黏附抑制剂的报道。这些抑制剂是将galabiose共价偶联到化学合成的高分子骨架[如minoethoxyl benzoic acid和poly(amidoamine)dendrimer等]上所形成的缀合物,其抑制活性可达纳摩级。但是,制备这些高分子骨架需要繁杂的化学反应过程,并且合成高分子难以满足日益增涨的药物安全性的要求。　　 为发展更加安全、实用的猪链球菌病防治药物,本研究选择天然多糖-壳聚糖(chitosan)为骨架,通过简单的N-alkylation反应负载galabiose侧链而快速制备了galabiose-chitosan缀合物1(图15,Page27)。HAI(血凝抑制)分析证实了其黏附抑制活性可达纳摩级,而SPR(Surface Plasmon Resonance)研究则论证了其高活性的分子机制。抗菌活性分析表明,壳聚糖骨架使得缀合物1具备了广谱的抗菌活性,包括直接杀死猪链球菌。与目前已知的同类多价猪链球菌黏附抑制剂相比,本研究通过采用壳聚糖为分子骨架负载猪链球菌的寡糖受体galabiose,(1)使抑制剂的制备工序得到大幅简化,提高了其作为实用药物的开发潜力；(2)使缀合物1成为目前已知的活性最高的猪链球菌黏附抑制剂之一；(3)使缀合物1具备了更高的生物兼容性,提高了其作为实际药物使用的安全性；(4)使缀合物1具备了其他的生物特性如抗菌性,有利于其进一步开发应用。总之,本研究为寻找更加安全、实用的猪链球菌防治药物提供了一条新的途径。　　 本研究合成了一系列不同DP(聚合度)和DS(取代度)的缀合物1,并研究了其分子结构与活性的关系(分析方法:血凝抑制分析)。研究结果表明,缀合物1的活性与DP和DS密切相关。DP适中的的缀合物1c(DP=1839)活性最高,其MIC(最小抑制浓度)为1.25 ng/ml(1.7 nM of galabiose moiety),与迄今为止己报道的活性最高的猪链球菌多价黏附抑制剂-octavalent galabiosidewith poly(amidoamine)dendrimer scaffold(MIC=2.4 nM)处于同一数量级。抑制活性和DS成正比,即DS越高,缀合物的抑制活性越高。这充分说明了缀合物1的多价效应是非常明显的。为了阐明1c高活性的分子机制,本研究用SPR技术表征了1c和α-Gal特异性的BSI-B4 lectin间的结合特性。结果表明两者间的亲和力非常大(Kd=39.6 nM),而阴性对照lactose-chitosan conjugate25(图21,page48)和chitosan和BSI-B4 lectin则没有结合。这些结果间接阐明了1c高活性的分子基础。本研究以大肠杆菌(DH5α,革兰氏阴性菌的代表株)、金黄色葡萄球菌(ATCC26113,革兰氏阳性菌的代表株)和猪链球菌(HA9801)为供试菌,检测galabiose侧链修饰后的壳聚糖(缀合物1)的抗菌性能。结果表明,缀合物1具备广谱的抗菌活性(包括直接杀死猪链球菌),其MIC(最小抗菌浓度)最低为0.15μg/mL。通过以上研究,本研究证明了缀合物1同时具备捕捉与直接杀死猪链球菌的双重功能。　　 总之,本研究选择具有多种生物特性的壳聚糖为作为多价黏附抑制剂的骨架,开发了简便、快速的缀合物1的制备方法,所得到的缀合物同时具有高效的抗猪链球菌黏附活性(MIC=1.7 nM Of galabiose moiety)和杀菌活性(MIC=0.15μg/mL)。同时,SPR研究论证了其高活性的分子机制。本研究可为猪链球菌病防治药物的研发提供新的思路,同时也可为糖类抗菌药物的开发提供新的借鉴和经验。　　 在生物体内,唾液酸与不同分子量的寡糖共价结合形成唾液酸寡糖,进而与蛋白、脂类结合形成糖蛋白和糖脂,分布于生物体的细胞表面,担当重要的生物学功能如充当病毒、细菌在细胞表面的黏附受体。唾液酸寡糖或其衍生物作为药物或药物前体,广泛应用于医疗行业。如唾液酸衍生物Sialyl LewisX作为重要的抗黏附药物,可有效阻止白细胞过量聚集,治疗类风湿性关节炎、脓毒性休克等疾病5。唾液酸的食物来源主要是母乳,尤其是初乳中的含量最高,可以寡聚糖、糖蛋白和糖脂形式存在。从奶或初乳中分离纯化是获得唾液酸寡糖的重要途径。传统的分离都是采用亲和层析法(特异的抗体作为吸附剂),虽然分离效果良好,但是,抗体制备繁琐、成本高,且亲和层析法不能应用于规模化制备。这些使得唾液酸寡糖的生产受到了严重制约。　　 本研究发展了一种简便的从富含唾液酸寡糖的牛初乳中纯化唾液酸寡糖的方法。首先,本研究参考吴培星等的方法,制备了五种不同分子量的唾液酸寡糖-壳聚糖离子复合物:先从牛初乳中提取含有唾液酸寡糖的糖提取物,然后用带正电荷的壳聚糖通过静电反应吸附糖提取物中的带负电荷的唾液酸寡糖,通过透析4天制备了水溶性好的唾液酸寡糖-壳聚糖离子复合物。然后,将制得的唾液酸寡糖-壳聚糖离子复合物再透析3-5天(不用换水),唾液酸寡糖发生一定程度的解吸附而渗透到透析膜外,冷冻干燥透析膜外的水溶液,可得到纯度较高的唾液酸寡糖。与传统的用特异的抗体作为吸附剂而纯化奶中的唾液酸寡糖的方法相比,本研究的方法简单、经济,可操作性强,具有较强的应用价值。因为壳聚糖具有调节机体免疫的功能,所以本研究探讨不同分子量的唾液酸寡糖-壳聚糖离子复合物对小鼠淋巴细胞增殖的影响。研究结果表明,10μg/mL复合物能有效地促进小鼠淋巴细胞的增殖,且低分子量的复合物的促进增殖能力高于高分子量的复合物。壳聚糖和唾液酸寡糖都有一定的促进细胞增殖能力,但是,其均低于唾液酸寡糖-壳聚糖离子复合物的促进增殖能力。这表明唾液酸寡糖-壳聚糖离子复合物整合了唾液酸寡糖和壳聚糖的免疫调节活性,是一种非常有效的免疫增强剂。总之,本研究为唾液酸寡糖的分离纯化提供了新方法,并为开发新型免疫增强剂提供了新途径。