肿大细胞病毒是造成广泛的淡水和海水养殖鱼类暴发性传染病的重要病毒性病原。国内最早于上世纪90年代初的养殖鳜暴发性流行病观察到，并最终被确认为鳜暴发性流行病的病原。根据该病毒引起的发病鳜的临床症状、病原及病理学特征定名为传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)。根据最新的国际病毒分类委员会第八次的分类报告(ICTV-8)，ISKNV被定义为虹彩病毒科(family Iridoviridae)新成立的肿大细胞病毒属(genus Megalocytivirus)的代表种。结合当前肿大细胞病毒研究的难点和热点，本文以鳜ISKNV为模式毒株，系统地研究了肿大细胞病毒的细胞培养体系并建立了高敏感细胞系。借助于该高敏感细胞系，我们首次分离到斑石鲷肿大细胞病毒(SKIV)并初步建立了鳜感染模型；进而对鳜ISKNV和斑石鲷SKIV进行了系统的蛋白质组学解析；成功研制出对ISKNV和SKIV具有高效免疫预防作用的全细胞灭活疫苗。此外，还研制出抗ISKNV的单克隆抗体。本研究从整体上初步解决了长期困扰我国的肿大细胞病毒的细胞培养问题、病毒的免疫预防问题和免疫诊断问题。同时，本研究还比较全面地揭示了病毒的主要编码蛋白，填补了国际上对肿大细胞病毒结构蛋白研究的空白。这些研究成果还为进一步的有关肿大细胞病毒感染与致病机理方面的研究奠定了良好且必要的物质基础。具体研究内容及取得的成果简述如下： 1.鳜仔鱼细胞系的建立及其对ISKNV的敏感性研究：本章报道建立一株鳜仔鱼细胞系MFF-1。该细胞系自2006年4月传代至今，两年内连续传代60余次，已经发展为一株上皮样细胞为主的连续细胞系。病毒感染试验显示，MFF-1对ISKNV高度敏感并通过免疫荧光、透射电镜和RT-PCR得以验证。流式细胞分析表明，用ISKNV特异性鼠抗ISKNV-VP23抗体作为标记物，三天内MFF-1对ISKNV的感染率达80.3％。电镜观察结果显示，以连续传代病毒感染MFF-1，感染细胞胞质内均可观察到大量球状病毒。利用ISKNV感染的MFF-1细胞上清回归感染健康鳜可导致大量死亡，其症状与自然暴发ISKNV病毒病症状类似。细胞凋亡试验表明，ISKNV对MFF-1的感染可以引起部分感染细胞凋亡。此外，利用MFF-1敏感细胞系，我们首次纯化到大量高纯病毒，并给出了病毒结构蛋白的蛋白凝胶电泳图谱。MFF-1是第一个来自于鳜的细胞系，同时也是第一个显示对ISKNV高度敏感的鱼类细胞系。 　　2.传染性脾肾坏死病毒对鳜原代细胞的感染特性研究：寻求新的细胞敏感原：自一尾健康鳜分离并成功培养出4种原代细胞，通过细胞免疫荧光技术(IFA)、透射电镜观察(TEM)、半定量PCR(RT-PCR)技术和Western-blot技术跟踪了ISKNV在4种鳜原代细胞的复制、基因和蛋白的表达情况，最后证实鳜脑原代细胞(MB)和鳍条原代细胞(MF)对ISKNV高度敏感，ISKNV可引起MB和MF形成肿大细胞病毒所特有的细胞病理效应(CPE)。性腺原代细胞(MG)和肾脏原代细胞(MK)则对ISKNV不敏感或低敏感。MB细胞已经体外培养了近30代，有望建成继MFF-1细胞之后的国内第二个肿大细胞病毒敏感细胞系，具有重要的应用价值。 3.斑石鲷肿大细胞病毒(SKIV)的分离、鉴定、系统发育分析及其对鳜的感染特性研究：利用MFF-1细胞系自湛江发病斑石鲷的脾脏分离到一株斑石鲷虹彩病毒，命名为SKIV-ZJ07。试验表明，SKIV-ZJ07能够在MFF-1上生长复制，可以引起典型的肿大细胞病毒细胞病变。透射电镜分析显示，SKIV-ZJ07感染的MFF-1细胞超薄切片可见大量晶格状排列或散装排列的球状病毒。利用肿大细胞病毒主衣壳蛋白(MCP)和ATP酶通用引物，克隆并测定了SKIV-ZJ07的MCP和ATPase基因序列全长；系统聚类分析显示，SKIV-ZJ07与此前报道的斜带石斑鱼虹彩病毒(OSGIV)和日本新近分离的真鲷虹彩病毒U1株(RSIV-U1)高度同源，而与鳜ISKNV的遗传距离较远。推测SKIV-ZJ07可能代表了当前我国海水养殖鱼类肿大细胞病毒病的主要流行毒株。利用MFF-1培养的SKIV-ZJ07感染鳜，能导致感染鳜100％死亡，并可观察到典型的传染性脾肾坏死病发病症状，电镜照片显示，发病鳜的头肾和脾脏可见大量晶格状排列病毒，上述结果显示，鳜对SKIV高度敏感，可作为海水鱼类肿大细胞病毒的淡水鱼类感染模型。SKIV鳜感染模型的建立为海水鱼类肿大细胞病毒疫苗的研究和应用提供了便利。 4.ISKNV和SKIV的蛋白质组学研究：利用差速离心结合二次蔗糖梯度离心技术分离纯化到大量高纯ISKNV和SKIV病毒粒子。利用基质辅助激光解析飞行时间质谱技术(MALDI／TOF MS)，对SDS-PAGE上的主要可见蛋白进行鉴定，结果ISKNV-NH0608有13个病毒蛋白得到可信鉴定，SKIV-ZJ07有23个病毒蛋白得到鉴定。进一步利用液质联用鸟枪法质谱技术(Shotgun LC-MS)对ISKNV在SDS-PAGE上的病毒蛋白进行鉴定，结果ISKNV共有37个病毒蛋白得到可信鉴定。ISKNV和SKIV是首个进行蛋白组学分析的肿大细胞病毒，填补了肿大细胞病毒结构蛋白研究的空白，将进一步推动肿大细胞病毒功能基因组学的研究。 5.ISKNV和SKIV疫苗的研究：利用原核表达技术成功表达鉴定了ISKNV-ORF006、ISKNV-ORF037、ISKNV-ORF115和ISKNV-ORF055等4个编码蛋白，结合质谱分析、免疫组化、免疫荧光和Western—blot分析结果可判断这4个蛋白为ISKNV的结构蛋白。利用上述纯化的蛋白为免疫原免疫健康鳜。同时利用0.1％福尔马林灭活ISKNV的MFF-1培养物为疫苗免疫鳜。免疫后30天，以107TCID50的病毒液腹腔注射攻毒，结果显示，基因工程苗对免疫鳜都没有明显的免疫保护作用，而全细胞灭活苗免疫鳜的存活率为100％。此外，免疫30天收集的全细胞灭活苗的免疫鳜血清在1：50稀释度内对鳜的中和保护效果为100％。我们的结果表明，ISKNV全细胞灭活苗可诱导鳜产生高效保护作用，免疫保护期不低于3个月，其免疫保护机制可能以体液免疫应答为主。此外，ISKNV免疫鳜也显示对SKIV有很好的免疫预防效果。 6.ISKNV单克隆抗体的制备及特性：利用杂交瘤细胞融合技术，通过细胞免疫荧光技术(IFA)和ELISA技术筛选到6株稳定分泌抗ISKNV的杂交瘤细胞株，并制备出大量的小鼠腹水，通过一维(1-DE)和二维(2-DE)电泳western-blot分析表明，其中的5株单抗(1F6，1G2，386，3F11和488)主要针对约35 kDa和49 kDa的病毒蛋白，其中的一株单抗(2D8)针对分子量约20 kDa的ISKNV结构蛋白，通过MALDI-TOF-MS分析，初步确认2D8为抗ISKNV-ORF101编码蛋白的杂交瘤细胞株，为进一步的病毒诊断，病毒基因功能的研究提供了方便可靠的物质基础。