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类胡萝卜素是一类具有抗氧化活性的脂溶性萜类化合物,广泛分布于蓝藻、真核藻类及高等植物体内,是光合中心的组成和功能元件,对光合作用中的捕光、光传递以及保护叶绿素分子免受高光伤害有重要的作用。此外,类胡萝卜素还具有重要的生理功能,能够提高免疫力、预防和治疗心血管疾病及癌症等,同时也广泛应用于食品、化妆品、饲料等工业领域。近年来对类胡萝卜素的生物合成途径关键酶和基因进行了系统研究,其中类胡萝卜素羟化酶是叶黄素类物质生物合成途径中重要的酶,能够催化不同胡萝卜素β-环和ε-环经羟基化生成中间产物,为下游叶黄素类物质的合成提供基础。 本文从经济绿藻小球藻和雨生红球藻出发,通过同源克隆和RACE方法克隆了类胡萝卜素羟化酶基因Ckecyp97a和Haecyp97c的全长cDNA,并在此基础上获得了两者的基因组序列,长度分别为6390 bp和3144 bp。通过生物信息学软件分析了其核苷酸和氨基酸序列,对其理化性质、跨膜结构域及亚细胞定位等进行了预测,Ckecyp97a和Haecyp97c蛋白均定位于叶绿体。 通过与其它真核微藻和高等植物中的CYP97家族成员比对发现,Ckecyp97a和Haecyp7c氨基酸序列中存在所有P450家族起催化作用的保守结构域,证明其属于CYP97家族。系统进化分析表明编码CYP97A和CYP97C的基因在进化上亲缘关系更近,说明具有共同的祖先,而编码CYP97B的基因是比较古老的基因。 利用基因组步移的方法克隆了Haecyp97c基因的5侧翼序列,发现存在多种激素响应元件,还有大量的启动子和增强子区域以及参与光应答的元件,这些顺式作用元件的预测为雨生红球藻类胡萝卜素合成调控机制的研究奠定了基础。 高光(白光和蓝光)诱导自养条件下的雨生红球藻和异养条件下的小球藻,利用荧光定量RT-PCR方法和高效液相色谱法分析了雨生红球藻和小球藻中类胡萝卜素羟化酶基因的表达模式和类胡萝卜素的积累。结果显示高光(白光和蓝光)诱导下雨生红球藻中类胡萝卜素羟化酶基因Hae cyp97c转录水平显著提高,同时玉米黄质和虾青素的浓度也显著上升,而且蓝光的刺激作用更为明显。而在小球藻中Ckecyp97a的转录水平在白光胁迫下显著提高,但蓝光胁迫下却降低了,同时在白光胁迫下玉米黄质的含量显著提高,远远高于蓝光处理下的实验组和对照组。结果表明雨生红球藻和小球藻对高光诱导的适应是一个需要这些基因共同参与的复杂过程,这些基因在转录水平上受到环境因子和培养条件的共同调控。 采用pET-28a(+)载体构建了三个类胡萝卜素羟化酶基因(Haecyp97a/b/c)的原核表达载体,IPTG诱导表达后SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组蛋白大小与预测一致,目的基因在大肠杆菌体内成功进行表达。进一步将构建好的原核表达载体转入能合成β-胡萝卜素的大肠杆菌体内,高效液相色谱分析色素组成发现底物β-胡萝卜素的含量确实下降了,但未检测到相应的产物,是否这些基因的催化作用导致了β-胡萝卜素含量的下降还有待进一步探讨。