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芽孢杆菌（Bacillus spp.）是一种嗜热、好氧的G+杆状细菌,该菌分布广泛,其能产生抗逆性强的芽孢、多种抗生素和酶类物质,是目前生防细菌中研究和应用较多的一类细菌。本实验室在此前利用解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B3菌株开发了生防制剂"麦丰宁",并对B3菌株进行了全基因组测序。测序结果显示,B3菌株具有一个内生质粒,并在其基因组中具有一个未知功能的NRPSs基因簇。环状双肽（Cyclicodipeptide,CDPs）是一种新发现的生物活性物质,具有抗细菌,真菌以及促进植物生长的功能,是一种良好的生防物质。本研究利用异源表达,放射性标记以及HPLC-MS等多种技术,对B3菌株内生质粒中发现的Rap-Phr系统,基因组中发现的新的非核糖体多肽合成酶基因簇,以及一个在Parachlamydia acanthamoebae UV-7基因组发现的一个环状双肽合成酶（CDPSs）基因簇进行了系统研究。主要内容包括:（1）B3内生质粒中Rap-Phr调控芽孢杆菌细胞分化的机理研究;（2）新的NRPSs基因簇中腺苷酰化功能域底物鉴定以及NRPSs基因簇异源表达系统的构建;（3）新的CDPSs产物与活性位点的鉴定,以及环状双肽生物学功能的研究。主要研究成果如下:1.首次在解淀粉芽抱杆菌B3内生质粒中发现了一个Rap-Phr系统,该系统可以同时调控产孢,surfactin合成与感受态的形成。产孢、溶血以及转化效率等表型实验结果表明,RapG能抑制芽孢杆菌OKB105菌株芽孢的形成,抑菌物质surfactin的产生以及感受态的形成。而在该菌株中共表达phrG因子或者添加人工合成的五肽（PhrG的成熟体）,则能恢复相应的表型。本研究还从基因转录水平对这些现象进行了佐证,分析的靶标基因分别为产孢相关基因spoIIE和surfactin合成基因srfAA。Real time PCR实验结果表明,在OKB105菌株中只表达rapG会抑制spoIIE和srfAA的表达,而共表达phrG因子或者添加人工合成的五肽,则能恢复这两个基因的表达。随后,构建了rapG和comA的大肠杆菌表达菌株,并纯化了重组蛋白。凝胶阻滞电泳（EMSA）实验结果表明,ComA能与surfactin合成操纵子srfA的启动子部位结合,从而起始该操纵子的转录,RapG能在体外与ComA结合,但不会抑制ComA与srfA启动子的结合,而是通过抑制RNA聚合酶与启动子的结合来抑制srfA的转录,最终导致不能合成surfactin和形成感受态细胞。而添加PhrG五肽则能抑制RapG蛋白的活性,恢复ComA的活性,从而恢复相应表型。2.鉴定了B3菌株中新的NRPSs基因簇合成为一个新的非核糖体七肽,并构建了沉默基因簇的TAR异源表达体系。芽孢杆菌能够产生丰富的抗菌物质,包括脂肽类、聚酮类、肽类、磷脂类和多烯类等。其中,通过非核糖体途後合成的脂肽类和聚酮类抗生素占芽孢杆菌抑菌物质的绝大部分。我们在解淀粉芽孢杆菌B3菌株中发现了一个新的非核糖体肽合成酶基因簇。通过序列分析,该基因簇含有两个非核糖体多肽合成酶（NRPSs）,—个TE基团,两个修饰基团,以及产物转运、表达调控相关基团。我们通过放射性标记、体外酶活性检测和质谱检测等技术,研究该基因簇的生物学功能以及鉴定相应产物。我们成功克隆和表达了该基因簇中6个A domain片段,通过ATP-PPi Exchange实验得到了这6个片段的酶学活性,获得了这6个A domain的特异性底物,获得了产物肽链部分的氨基酸序列。根据肽链序列,我们使用放射性标记底物尝试鉴定基因簇产物,但未检测到相应物质。表达了修饰蛋白,尝试进行了体外活性的检测,但未检测到相关活性。由于B3菌株遗传操作困难,难以获得相应的突变体,我们还建立了酵母捕获技术,利用酵母菌作为宿主菌,采用TAR克隆（Transformation-associated recombination cloning）技术,成功获得了1000多个转化子,成功构建了TAR克隆体系。3.首次发现了环状双脯氨酸合成酶编码基因并解析了其合成机理,并发现了环状双肽生物学功能的直接证据。CDPSs（环状双肽合成酶）,可利用核糖体途径中的加载到tRNA上的氨基酸,合成环状双肽。通过PSI-Blast,我们在Parachlamydiaacanthamoebae UV-7菌株基因组中,发现了一个CDPS编码基因pah（puv17450）,并在其下游发现了一个编码LuxR家族蛋白基因puv17460。通过在大肠杆菌中的异源表达,我们鉴定了环状双肽合成酶Pah的主要合成产物为环状双脯氨酸（cPP,cyclicdi-L-proline）。并通过定点突变的方法,发现其催化中心为第46位苏氨酸残基（S46）,第188位天冬氨酸残基（D188）以及第192位天冬酰胺残基（Q192）。还发现,Pah a-4helix上的正电荷氨基酸残基突变后cPP产量下降;a-6与a-7之间loop上带正电荷与负电荷氨基酸残基被突变后,cPP产量上升,但酶的专一性下降,cPF,cPV等副产物产量上升。并在大肠杆菌中异源表达了基因簇中的LuxR蛋白,发现其以双体（dimer）的形式存在,并且不稳定,在高浓度时极易沉淀。实验还表明该LuxR蛋白可以同cPP结合,并且cPP可以改变其双体的结合方式,延长LuxR dimer在分子筛上的保留时间。使用蛋白变性后,可以检测到cPP的存在。体内的实验结果也表明cPP可以在体内作为LuxR的信号分子。本文首次在解淀粉芽孢杆菌中发现质粒中的Rap-Phr系统,并发现其可以同时调控产孢、surfactin合成和感受态形成,为生防芽孢杆菌的遗传改造提供了理论依据。并鉴定了一个未知的NRPSs基因簇,并发现其产物为一个新的非核糖体七肽类物质;构建了一个TAR克隆体系,为沉默NRPSs基因簇的异源表达与遗传操作提供了一个良好的技术平台。首次发现了双脯氨酸合成酶,并解析了其合成机理;并首次发现了环状双肽的生物学功能,可以作为LuxR家族蛋白的信号分子。cPP可以促进植物的生长,该研究为cPP的生物合成,改造与应用提供了资源与理论依据。