慢性疼痛是世界范围内最常见的慢性疾病之一,如炎症痛、神经病理性痛和癌痛。常常引起焦虑与抑郁,从而加重患者的经济和心理负担。关于慢性痛的机制,研究最多的是神经元的可塑性改变。其中初级感觉神经元的过度兴奋和敏化(外周敏化),以及由转录、翻译和翻译后调节引起的脊髓、脑干和皮层神经元兴奋性突触传递的增强(中枢敏化)是目前认为最主要的两种机制。其它的神经元机制包括去抑制(减少抑制性突触传递),下行途径易化(如从脑干到脊髓),以及皮层和脊髓的长时程增强。这些神经元的改变参与持续疼痛的发展,与维持密切相关。近年来,人们逐渐认识到,背根节的胶质细胞—卫星细胞也参与慢性痛的发生发展。中枢神经系统损伤后,胶质细胞常常发生一定程度的去分化,甚至具备神经元发生的潜能。在外周神经系统,颈动脉体和肠神经节的胶质细胞在慢性缺氧和肠炎的情况下,会产生新的神经元,以适应疾病情况下机体功能的需求。考虑到背根节的卫星细胞在发育上与颈动脉体和肠神经节的胶质细胞都来自神经嵴,慢性痛情况下受累的背根节接收持续性的外周刺激,我们猜想:慢性痛情况下,背根节的卫星细胞是否也具有神经元发生的潜能?如果具有,卫星细胞可能以一种前所未料的方式参与慢性痛的病理改变。因此,本课题着重研究慢性痛条件下背根节的神经元发生及卫星细胞在其中的作用。研究由如下四部分实验组成:第一部分:慢性痛后背根节卫星细胞的活化目的:观察慢性痛后不同亚群卫星细胞的激活;方法:利用免疫荧光组织化学染色方法及BrdU掺入实验观察慢性痛后7天、14天不同亚群卫星细胞的增殖及去分化;结果:SNI和CFA处理都会诱导痛损伤侧背根节中Sox阳性、GFAP阳性和PDGFRα阳性卫星细胞增殖,并且诱导Sox阳性、GFAP阳性卫星细胞上调Nestin,PDGFRα阳性卫星细胞上调Sox10与Nestin。结论:慢性痛可诱导背根节卫星细胞的活化。第二部分:慢性痛条件下背根节的神经元发生目的:观察慢性痛条件下神经元的发生及新生神经元的类型;方法:采用BrdU掺入和DNA损伤/修复标记蛋白检测;结果:在痛诱导后14天和28天,我们分别观察到神经元标记蛋白DCX和NeuN与BrdU的双标,提示慢性痛可能诱导背根节神经元新生。神经元类型分析发现,BrdU主要存在于IB4和CGRP阳性的伤害性神经元中,而未与触觉感觉神经元(NF200阳性的神经元)共标。DNA损伤修复标记蛋白(γ-H2A.X)主要表达于损伤同侧背根节NF200阳性神经元;结论:慢性痛可诱导背根节中神经元新生,新生神经元主要为IB4阳性和CGRP阳性的伤害性感觉神经元。第三部分:慢性痛条件下新生神经元的来源目的:追踪慢性痛条件下神经元发生的起源;方法:采用基于Cre的细胞谱系追踪方法,用三种基因修饰小鼠对慢性痛下新形成的神经元进行细胞命运追踪;结果:基于PDGFRα-CreER:ROSA/YFP小鼠的细胞命运追踪未发现YFP标记的神经元。而采用GFAP-CreER:ROSA/YFP小鼠的细胞命运追踪结果显示,GFAP阳性细胞仅能产生IB4阳性的神经元;进而基于Sox2-CreER:ROSA/YFP小鼠,发现慢性痛模型下,Sox2阳性细胞可以产生IB4阳性和CGRP阳性神经元,且慢性痛时阻断外周钠通道活动可减少Sox2阳性卫星细胞来源的DRG神经元新生。结论:慢性痛条件下,PDGFRα阳性的卫星细胞不能产生新的神经元;GFAP阳性的卫星细胞仅能产生IB4阳性神经元;Sox2阳性的卫星细胞能够产生IB4阳性和CGRP阳性的神经元,且实验提示慢性痛诱导的DRG神经元新生依赖于外周传入。第四部分:胶质源性新生神经元功能特性的初步探索目的:检测新生的胶质源性神经元的电生理特性,及其对capsicin的反应和TRPV1的表达;方法:实验采用全细胞膜片钳记录、生物胞素细胞内标记及免疫荧光组织化学法;结果:Sox2-CreER:ROSA/YFP小鼠或GFAP-CreER:ROSA/YFP小鼠背根节内YFP阳性神经元能够发放动作电位。与YFP阴性小细胞神经元相比,在同等刺激条件下,YFP阳性神经元动作电位的发放次数较少,阈电位较低,基强度较高。膜静息电位和动作电位幅值无显著性差异。约44%的YFP阳性神经元可对辣椒素(capsicin)发生反应。SNI或CFA处理后1个月,约18%的YFP阳性神经元表达TRPV1;结论:慢性痛情况下背根节的新生神经元具备神经元的电生理特性。