卵巢癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一,其发病率居妇科肿瘤第三位；然而由于卵巢癌患者以腹水或盆腔包块就诊时,多数已是临床晚期,其死亡率高居妇科恶性肿瘤首位,5年生存率仍然徘徊在30%左右。目前尚缺乏对卵巢癌发生发展的确切分子机制的了解,因此,探索卵巢癌的发病机制,研究参与卵巢癌发生、发展的相关分子,可以为其诊断及靶向治疗奠定理论基础和提供实验依据。肿瘤发生侵袭和转移是一个多因素参与的极其复杂的过程。研究表明,在诸多影响肿瘤发生、发展及转移的因素中,生长因子介导的细胞内信号转导通路同肿瘤的进展关系密切,一直是近年来肿瘤研究领域人们关注的热点。众多因子在其中发挥调节作用,其中肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)是目前已知生物活性最广泛的生长因子之一。研究表明HGF在促进细胞分裂、增殖、分化、运动及形态的发生、血管生成等方面发挥重要的生物学功能。HGF在细胞内可通过多条信号通路发挥调节作用,其中有丝分裂原活化蛋白激酶途径和3-磷脂酞肌醇激酶途径是最重要的两个生长因子信号转导通路,调节生长、增殖、分化及恶性转化等许多细胞过程,与肿瘤的恶性进展及预后关系密切。HGF作用于受体c-Met,刺激信号传入细胞内,启动系列的级联反应,导致多种底物蛋白磷酸化,从而引起细胞内一系列信号传导,引发下游某些特定分子的表达和生物学效应。然而,HGF发挥作用的分子调控机制尚不清楚,探讨HGF在卵巢癌侵袭生长过程中的作用及其信号传导途径,对于阐明卵巢癌发生发展的分子机制及靶向治疗有着重要意义。凝血酶敏感蛋白1(Thrombospondin, TSP-1)是一具有多种生物学功能的糖蛋白,在调节肿瘤细胞的生长、粘附、凋亡等生物学行为和肿瘤新生血管形成中发挥重要作用,目前TSP-1与卵巢癌关系的研究仍局限于表达异常方面,TSP-1对卵巢癌细胞生物学功能影响的研究尚未见报道。研究发现TSP-1在细胞中的表达可能受到多种机制的调控,比如,生长因子、癌基因及抑癌基因等。目前有关HGF及TSP-1在卵巢癌的表达及其作用机制中可能存在的相互联系,国内外均未见报道。本研究旨在探讨卵巢癌发病的分子机制,为研究治疗卵巢癌的方法提供新的特异性靶点。基于HGF及TSP-1在调控细胞凋亡、周期和侵袭生长中起着重要作用,本研究分为三部分：第一部分主要探讨HGF与TSP-1在卵巢癌组织中表达的相互关联；第二部分检测了HGF对卵巢癌SKOV-3细胞中TSP-1表达的调节作用,并构建了TSP-1真核表达载体转染SKOV-3细胞,进一步研究TSP-1在HGF调控下卵巢癌细胞生物学行为中的作用,初步探讨HGF的作用途径及机制；第三部分应用MAPK/ERK及PI3K/AKT信号通路的特异性阻断剂,研究了该信号通路在HGF介导的SKOV-3细胞生物学行为中的作用,为进一步了解HGF在卵巢癌发病进展中的作用机制提供新策略。第一部分HGF及TSP-1在卵巢癌组织中的表达【研究目的】(1)检测HGF及TSP-1在卵巢癌及良性卵巢肿瘤组织中的表达水平,探讨两者与卵巢癌临床病理因素的关系。(2)研究卵巢癌组织中HGF与TSP-1在蛋白表达水平的相关性,以进一步了解HGF与TSP-1之间存在的关系。【研究方法】(1)应用实时荧光定量PCR检测卵巢癌和良性卵巢肿瘤组织中HGF及TSP-1基因mRNA的表达。(2)免疫组织化学法检测卵巢癌和良性卵巢肿瘤组织中HGF及TSP-1蛋白的定位及表达。【结果】(1)HGF及TSP-1 mRNA在卵巢癌和良性卵巢肿瘤组织中的表达：HGF mRNA在卵巢癌组织中的表达水平和阳性表达率均显著高于良性肿瘤组织P＜0.05),卵巢癌中的HGFmRNA的相对表达水平为7.43±0.90,HGF阳性率分别为89.47%及35%。而TSP-1 mRNA在卵巢癌组织中的表达水平和阳性表达率均低于良性肿瘤组织(P＜0.05),卵巢癌中的TSP-1 mRNA的相对表达水平仅为0.34±0.03,阳性率分别为36.84%及75%。(2)HGF蛋白在卵巢癌和良性卵巢肿瘤组织中的表达：在卵巢良性肿瘤组织中,HGF蛋白在上皮细胞基本无着色,HGF阳性表达率为22.73%。在卵巢癌中,HGF呈现不同程度的高表达,主要表现为肿瘤细胞胞浆着色,阳性表达率为74.29%,显著高于良性肿瘤组织(P＜0.05)。卵巢癌组织中HGF蛋白的阳性表达与患者的年龄、病理分级无关,而与FIGO分期、淋巴结转移情况相关(P＜0.05)。(3)TSP-1蛋白在卵巢癌和良性卵巢肿瘤组织中的表达：在卵巢良性肿瘤组织中,TSP-1蛋白在上皮细胞中多呈强阳性表达,阳性表达率为77.27%。在卵巢癌中TSP-1蛋白阳性表达部位主要在肿瘤细胞的胞浆内及少量间质,呈弱阳性表达,阳性表达率为40%,与良性肿瘤组织相比明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。卵巢癌中TSP-1蛋白表达缺失与FIGO分期、病理分级明显相关(P＜0.05),而与年龄及淋巴结转移无关。(4)HGF及TSP-1蛋白在卵巢癌组织中表达水平的相关性：HGF阳性表达的52例中,TSP-1阳性表达仅为14例；HGF阴性表达的18例中,TSP-1阳性表达14例。两者阳性表达强度在卵巢癌组织中呈负相关(rs=-0.575),且相关有显著性意义(P＜0.01)。【结论】在卵巢癌组织中,HGF存在过度表达,而TSP-1表达下调,两者具有相关性。第二部分HGF对卵巢癌细胞TSP-1表达的调控及其生物学行为的影响【研究目的】(1)检测外源性HGF对卵巢癌SKOV-3细胞株中TSP-1表达的调节。(2)探讨TSP-1在HGF调控下的卵巢癌细胞生物学行为中的作用,对HGF调控卵巢癌细胞增殖、凋亡及侵袭的作用途径及可能机制做一初步探索。【研究方法】(1)实时定量PCR法及Western blot检测不同浓度HGF作用SKOV-3细胞不同时间对TSP-1mRNA及蛋白水平表达的影响。(2)将空质粒pEGFP-N1及重组质粒pEGFP-N1-TSP-1分别转染入SKOV-3细胞,在倒置荧光显微镜下观察转染后TSP-1在SKOV-3细胞中的定位与表达,并用Western Blot法检测TSP-1蛋白的表达。(3)转染后细胞分为如下6组：SKOV-3组;HGF+ SKOV-3组;SKOV-3/pEGFP组；HGF+ SKOV-3/pEGFP组;SKOV-3/TSP-1组;HGF+ SKOV-3/TSP-1组。进行以下SKOV-3细胞生物学行为的检测。(4)MTT法检测TSP-1对HGF调控的SKOV-3细胞增殖活性的影响。(5)流式细胞仪检测TSP-1对HGF调控的SKOV-3细胞周期分布及cyclin D1蛋白表达的影响。(6)流式细胞仪检测TSP-1对HGF调控的SKOV-3细胞凋亡率的影响。(7) Transwell实验检测TSP-1对HGF调控的SKOV-3细胞侵袭力及MMP-9含量的影响。【结果】(1)HGF下调卵巢癌SKOV-3细胞中TSP-1的表达水平：随着HGF作用浓度的增加及作用时间的延长,TSP-1mRNA表达水平逐渐降低(P<0.05), HGF对TSP-1mRNA表达的调控作用呈一定的剂量依赖性及时间依赖性。Western blot结果显示,TSP-1蛋白水平的变化与mRNA水平是一致的。(2)重组质粒pEGFP-N1-TSP-1瞬时转染SKOV-3细胞：倒置荧光显微镜下显示SKOV-3/pEGFP细胞中,绿色荧光呈整个细胞内的均一弥散分布。而SKOV-3/TSP-1细胞,只在细胞浆中可见绿色荧光。Western blot结果表明,SKOV-3/TSP-1细胞中TSP-1蛋白的表达明显增加(P＜0.05)。(3)TSP-1转染明显降低了HGF对SKOV-3细胞促增殖活性：细胞生长曲线显示,各组细胞中加入HGF后,细胞增殖明显加快(P＜0.05)。与HGF+SKOV-3/pEGFP组相比,HGF+SKOV-3/TSP-1组细胞增殖显著减弱(P＜0.05)。(4)TSP-1转染明显改变了HGF调控的SKOV-3细胞周期分布及cyclin D1的蛋白表达：在HGF的刺激作用下,细胞的周期分布出现明显改变,各组S期细胞比例均有显著提高(P<0.05), cyclin D1表达也明显升高(P＜0.05)。HGF+SKOV-3/TSP-1组细胞与HGF+SKOV-3/pEGFP组相比,S期细胞比例及cyclin D1表达明显降低(P＜0.05)。(5)TSP-1转染对HGF调控的SKOV-3细胞抑制凋亡作用无影响：HGF处理后各组细胞凋亡数明显减少(P＜0.05),但比较HGF+SKOV-3/TSP-1组与HGF+SKOV-3/pEGFP组发现,两组凋亡细胞数无显著差别(P＞0.05)。(6)TSP-1转染显著减少了HGF对SKOV-3细胞侵袭力及上清液中MMP-9含量的影响：HGF处理后各组细胞透膜细胞数均有增加(P＜0.05),并且诱导MMP-9分泌增加。而比较HGF+SKOV-3/TSP-1组与HGF+SKOV-3/pEGFP组穿透细胞数及MMP-9分泌量可见,HGF+SKOV-3/TSP-1组细胞的侵袭能力及MMP-9含量明显降低(P＜0.05)。【结论】HGF通过降调TSP-1的表达,促进卵巢癌细胞的增殖及侵袭,其机制可能与cyclin Dl和MMP-9表达上调有关。第三部分MAPK/ERK信号通路在HGF调控卵巢癌细胞生物学行为中的作用【研究目的】探讨MAPK/ERK及PI3K/AKT通路在HGF对SKOV-3细胞中TSP-1的调控表达及诱导产生生物学行为中的作用。【研究方法】(1)Western blot检测外源性HGF及信号通路抑制剂对SKOV-3细胞中ERK1/2、AKT磷酸化及TSP-1蛋白表达的影响。(2)MTT法检测MAPK/ERK信号通路对SKOV-3细胞增殖活性的影响。分组如下：空白对照组；HGF组；HGF+U0126组。(3)流式细胞仪检测MAPK/ERK信号通路对SKOV-3细胞周期分布及cyclin D1蛋白表达的影响。(4)流式细胞仪检测MAPK/ERK信号通路对SKOV-3细胞凋亡率的影响。(5) Transwell体外实验检测MAPK/ERK信号通路对SKOV-3细胞侵袭力及MMP-9含量的影响。【结果】(1)HGF诱导SKOV-3细胞MAPK/ERK及PI3K/AKT信号通路的激活：HGF迅速诱导了SKOV-3细胞中p-ERK1/2及p-AKT的表达水平(P＜0.05)。p-AKT与p-ERK1/2的表达类似,在HGF刺激后5min即出现,在15min达到最大效应。(2)U0126可以阻断HGF对TSP-1下调表达的调控：预先加入U0126或LY294002后,HGF则不能诱导ERK1／2及AKT发生磷酸化；预先加入U0126后,HGF下调TSP-1蛋白表达的作用消失(P<0.05)；而预先加入LY294002后,HGF依然可以下调TSP-1蛋白的表达。(3)阻断MAPK/ERK信号通路明显降低了SKOV-3细胞增殖活性：U0126的预处理明显减少了HGF诱导的细胞增殖活性,与HGF组之间比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。(4)阻断MAPK/ERK信号通路明显改变了SKOV-3细胞周期分布及cyclin D1表达水平：U0126明显减少了HGF引起的细胞S期比例,与HGF组相比存在显著性差异(P＜0.05)；同时cyclin D1表达水平也明显减弱。(5)阻断MAPK/ERK信号通路对SKOV-3细胞凋亡率无影响：U0126组与HGF组相比,两组之间凋亡细胞所占百分比无明显差异(P＞0.05)。(6)阻断MAPK/ERK信号通路降低了SKOV-3细胞侵袭力及MMP-9的含量：U0126显著减少了HGF所诱导的侵袭细胞数量,与HGF组相比存在明显差异(P<0.05)。ELISA结果显示MMP-9水平的变化与侵袭细胞数目一致,HGF组与U0126组细胞上清液中MMP-9的分泌量比较,差异显著(P＜0.05)。【结论】HGF通过MAPK/ERK信号通路实现对卵巢癌细胞TSP-1的表达调控。