目的：吡咯喹啉醌(Pyrroloquinolinequinone，PQQ)是20世纪70年代末发现的一种脱氢酶的辅酶，广泛存在于革兰氏阴性细菌中。PQQ具有刺激某些微生物和动植物生长、防治肝损伤、促进神经生长因子生成、调节体内自由基水平等多种生理功能。人和动物细胞自身不能合成PQQ，被认为是一种新的B族维生素。PQQ具有很好的应用前景，但化学合成步骤繁多，造价昂贵，生物合成被认为是一条最有前景的生产路线。PQQ生物合成不仅是一个理论问题，对于PQQ生产工艺的开发也具有重要意义。PQQ生物合成基因的分离和表达将为PQQ生物合成研究奠定重要基础。建立毗咯喹啉醌(PQQ)分析和检测方法，从氧化葡萄糖杆菌中分离PQQ生物合成基因，并实现在大肠杆菌中表达。 方法：山梨糖脱氢酶是维生素C(Vc)的二步发酵中的一个关键酶，这是一种醌酶，其活性严格依赖于PQQ。由于大肠杆菌自身不能合成PQQ，在大肠杆菌中表达的山梨糖脱氢酶是一种不具活性的脱辅基醌蛋白。这种脱辅基醌蛋白能够与PQQ重组成为具有生物活性的全酶。据此，我们建立了PQQ的体内检测和体外分析方法。利用Red重组技术将山梨糖脱氢酶基因整合至大肠杆菌染色体。构建了两翼与大肠杆菌ptsG基因上下游序列同源，中间为氯霉素抗性基因和山梨糖脱氢酶基因的表达载体，将载体酶切为线性片段，通过电转化导入大肠杆菌，对应的序列ptsG基因被置换下来，得到了能够稳定表达山梨糖脱氢酶的大肠杆菌整合菌株。这一改建的宿主菌可供PQQ体内生物合成的检测。将外源的PQQ生物合成基因导入该宿主菌，能够表达具有生物活性的山梨糖脱氢酶。利用SDH对PQQ的依赖性，还建立了体外测定PQQ含量的重组酶分析法。将大肠杆菌表达的脱辅基山梨糖脱氢酶纯化，用这种纯化的酶在体外与检测样品中的PQQ重组，通过测定山梨糖脱氢酶活性可以定量分析样品中PQQ含量。本论文首创了一种用于PQQ生物合成基因的检测方法，分离得到了一种新的PQQ生物合成基因，并且实现了PQQ基因和SDH基因同时在大肠杆菌DH5中的表达。PQQ生物合成基因的分离和表达为研究PQQ生物合成途径和调控机制以及构建PQQ高产工程菌奠定了基础。利用山梨糖脱氢酶对PQQ的依赖性建立了重组酶法检测方法；利用PCR和CassettePCR方法扩增和分离目的基因。 结果：氧化葡萄糖杆菌Y24具有将山梨醇转化为山梨糖的功能，研究发现该菌能够产生PQQ。根据PQQ生物合成基因中pqqE的保守序列设计引物从Y24的基因组上扩增得到pqqE的部分序列，该序列与氧化葡萄糖杆菌ATCC9937的pqqE基因序列具有77％同源性。利用这段序列通过CassettePCR的方法成功扩增克隆得到Y24的完整PQQ生物合成基因。将携带Y24PQQ完整生物合成基因的质粒导入整合有山梨糖脱氢酶的DH5菌株，检测到具有生物活性的山梨糖脱氢酶，表明外源的PQQ生物合成基因在大肠杆菌中表达，并能够实现PQQ的生物合成。建立了重组酶法检测PQQ的方法；从氧化葡萄糖杆菌Y24基因组分离得到了PQQ生物合成基因；在大肠杆菌中实现了外源PQQ合成基因表达和PQQ的生物合成。 结论：分离得到氧化葡萄糖杆菌Y24的PQQ生物合成基因，该基因能够在大肠杆菌中表达并指导PQQ的生物合成。