哮喘病是一种常见的慢性呼吸道疾病,更是对人类健康最具危害的非传染性重大疾病之一。然而哮喘的发病机制至今尚未被完全揭示,这也是临床上对哮喘始终缺乏有效治愈方法的根本原因。一般认为哮喘病理机制涉及气道炎症、气道组织重构和气道高反应性(Airway Hyperresponsiveness,AHR)等诸多复杂因素。在这些病理因素中,气道炎症被认为是哮喘发病的重要病理基础,其最显著的特征是气道内存在大量炎症细胞的浸润。因此,炎症细胞从血管系统中被招募并迁移至气道的过程,对于哮喘气道炎症乃至整个哮喘的发病是至关重要的,但这一过程的调控机制尚未被解释清楚。已有相关研究提示,解整合素金属蛋白酶8(A Disintegrin and Metalloprotease 8,ADAM8)在这个过程中扮演着重要的角色:ADAM8被证实是一个与中度到重度过敏性哮喘极为相关的哮喘易感基因,其mRNA的表达在哮喘患者的唾液、支气管活检组织和卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)致敏性哮喘小鼠的肺组织中被发现有显著增高;ADAM8可被炎症刺激物诱导表达,且在体外被证实可参与多种炎症因子、细胞粘附因子和细胞外基质蛋白的催化或降解;由于ADAM8在哮喘肺组织中主要高表达在支气管、微血管周围的炎症细胞及气道上皮细胞中,因此ADAM8被认为可能通过调控炎症细胞在气道组织中的招募和迁移,参与到哮喘气道炎症的发生和发展中。尽管有关ADAM8基因敲除型哮喘小鼠的研究结果提示,ADAM8是一个潜在的哮喘治疗药物靶点,然而对于ADAM8在哮喘气道炎症中究竟是促进了还是抑制了炎症细胞的招募这一问题,学术界仍存有较大的争议,且目前相关研究主要集中在动物模型层次,缺少一个细胞水平的系统性研究。另一方面,在这些炎症细胞中,巨噬细胞具有参与宿主防御、吞噬细胞凋亡残体和促进其他炎症细胞在气道中的早期招募等功能,在哮喘气道炎症中起到了至关重要的作用;前期研究提示ADAM8可能通过参与巨噬细胞与病原体的接触从而影响了其活性、粘附能力、吞噬能力等生理功能,然而有关ADAM8对巨噬细胞生理功能的影响及其潜在的力学调控机制,目前尚未见系统性的报道。这些问题的存在阻碍了我们对ADAM8参与哮喘气道炎症机制的理解,并制约了ADAM8作为药物靶点用于哮喘治疗的可能性。　　因此,为了阐述清楚ADAM8的表达对于巨噬细胞生理功能的影响及其潜在的力学机制,进一步理解ADAM8在炎症细胞迁移中所扮演的角色,并探索一个以ADAM8为药物靶点的哮喘治疗新方法,本研究通过慢病毒转染技术调控了ADAM8在巨噬细胞中的表达,并检测了ADAM8超表达或沉默时,巨噬细胞在非激活状态或免疫激活状态(通过Lipopolysaccharide,即LPS诱导激活)下其活性、粘附、迁移、吞噬、凋亡等生物学行为以及硬度、收缩力、流变性质等力学行为的变化,并在此基础上验证了一种针对ADAM8设计的特异性肽抑制剂在OVA致敏性小鼠哮喘模型中的治疗作用。主要研究内容和结果如下:　　1)调控ADAM8基因的表达改变了巨噬细胞迁移、粘附、增殖和吞噬的能力,但不影响巨噬细胞的内源性凋亡过程。构建ADAM8基因超表达和干扰慢病毒重组载体,通过慢病毒转染的方法将ADAM8在巨噬细胞中的基因和蛋白表达水平分别提高了2倍至3倍或下降了60％至70%。在此基础上,通过MTT增殖实验检测发现,无论给予或不给予LPS处理,提高ADAM8的表达均促进了巨噬细胞的活性及其增殖能力,其中在72h处分别提高约20%和40%(P<0.05);无论给予或不给予LPS处理,抑制ADAM8的表达对巨噬细胞的活性均没有影响。通过粘附实验检测发现,提高ADAM8的表达对经LPS处理的巨噬细胞粘附于内皮细胞的能力有促进作用,可提高约20%(P<0.05),而对未经LPS处理的巨噬细胞的粘附能力没有影响;无论给予或不给予LPS处理,抑制ADAM8的表达均降低了巨噬细胞在内皮细胞上的粘附,分别下降约30%和40%(P<0.05);通过划痕实验检测发现,无论给予或不给予LPS处理,提高ADAM8的表达均促进了巨噬细胞的侧向迁移能力,分别提高约30%和20%(P<0.05);无论给予或不给予LPS处理,抑制ADAM8的表达均降低了巨噬细胞的侧向迁移能力,分别下降约40%(P<0.01)和30%(P<0.05)。通过Transwell实验检测发现,无论给予或不给予LPS处理,提高ADAM8的表达均促进了巨噬细胞纵向迁移的能力,分别提高约30%(P<0.05)和40%(P<0.01);无论给予或不给予LPS处理,抑制ADAM8的表达均降低了巨噬细胞的纵向迁移能力,分别下降约50%(P<0.05)和80%(P<0.01)。通过吞噬实验检测发现,无论给予或不给予LPS处理,提高ADAM8的表达对巨噬细胞吞噬细菌微粒的能力没有显著影响;无论给予或不给予LPS处理,抑制ADAM8的表达均阻碍了巨噬细胞的吞噬能力,分别下降约40%和30%(P<0.05)。通过凋亡实验检测发现,ADAM8的表达对于巨噬细胞内源性凋亡的过程无明显影响。　　2)调控ADAM8基因的表达影响了巨噬细胞的细胞刚度和流变性质,但不影响其收缩力。通过光学磁微粒扭转细胞测量技术检测发现,ADAM8表达的增高对经LPS处理的巨噬细胞的细胞刚度有提高作用,提高约40%(P<0.05),而对未经LPS处理的巨噬细胞的细胞刚度没有显著影响;另外,无论给予或不给予LPS处理,抑制ADAM8的表达对巨噬细胞的细胞刚度均没有显著影响。另一方面,ADAM8表达的增高对经LPS处理的巨噬细胞的细胞骨架响应外界刺激发生重塑的能力有提高作用,提高约20%(P<0.05),而对未经LPS处理的巨噬细胞的流变性质没有显著影响;无论给予或不给予LPS处理,抑制ADAM8的表达对巨噬细胞的流变性质没有显著影响。另外,无论给予或不给予LPS处理,ADAM8的表达对于巨噬细胞的收缩力没有显著影响。　　3)ADAM8肽抑制剂BK-1361通过阻碍OVA致敏性哮喘小鼠气道中嗜酸性粒细胞和Th2细胞因子介导的气道炎症有效缓解了其气道高反应性及气道重构等哮喘症状。通过全身体积描记法检测发现,BK-1361的使用降低了由乙酰胆碱诱导的哮喘小鼠气道阻力(P<0.05),其中25μg/g和50μg/g小鼠体重药物浓度在50mg/mL乙酰胆碱浓度处可将气道阻力降低约50%(P<0.05)。通过肺组织切片观察发现,BK-1361的使用抑制了哮喘小鼠的气道组织重构的严重程度(P<0.05),其中25μg/g小鼠体重药物浓度可将气道组织病理评分降低约50%(P<0.05)。通过肺泡灌洗液中白细胞总数计数和分类计数检测发现,BK-1361的使用阻碍了哮喘小鼠气道中炎症细胞、特别是嗜酸性粒细胞的浸润和侵袭(P<0.05),其中25μg/g小鼠体重药物可将炎症细胞和嗜酸性粒细胞计数分别降低约50%和60%(P<0.05)。通过实时定量PCR检测发现,BK-1361的使用降低了哮喘小鼠肺组织中Th2细胞因子的基因表达(P<0.05),其中25μg/g小鼠体重的药物浓度对各种Th2细胞因子的整体控制效果较好。通过酶联免疫吸附测定技术检测发现,BK-1361的使用可将哮喘小鼠肺匀浆中ADAM8催化剪切CD23的产物sCD23的含量降低约40%至50%(P<0.05),但不影响ADAM8自激活的产物sADAM8的含量;总体而言,25μg/g小鼠体重的药物浓度对OVA致敏性小鼠哮喘的控制效果最好。　　上述研究结果表明1)ADAM8可能通过提高巨噬细胞的迁移能力及其粘附于内皮的能力,促进哮喘气道炎症中巨噬细胞和其他炎症细胞从血管系统到气道组织的招募和迁移;2)ADAM8可能通过释放相关炎症因子和生长因子,激活哮喘气道炎症中巨噬细胞和其他炎症细胞的炎症响应,从而加速哮喘气道炎症的发生和发展;3)ADAM8可能通过直接影响巨噬细胞的力学特性从而在巨噬细胞生理功能中发挥重要的调节作用;4)使用肽抑制剂BK-1361短暂抑制ADAM8在体内的催化活性是一种相对安全的、效率较高的且具有较好疗效的实验性哮喘治疗新方法。　　以上研究结果一方面对于我们进一步认识和理解ADAM8在哮喘气道炎症中的作用,特别是其表达对巨噬细胞生理功能的影响及相关力学调控机制,并从细胞水平解释不同研究结果中存在的矛盾具有重要的意义。另一方面本研究证实了ADAM8作为药物靶点用于实验性哮喘治疗的可能性,并为基于药物抑制ADAM8功能这一治疗思路开发临床哮喘新药物提供了详实的动物实验数据。