一、研究背景抗蛇毒血清是世界卫生组织推荐的治疗毒蛇咬伤的唯一特效药物。从世界范围内看，目前抗蛇毒血清仍然是通过免疫马或羊等动物来获得。然而，蛇毒是一种复杂的蛋白质、多肽混合物，其中部分具有很强抗原性的毒素，却没有或只有很弱的免疫原性；部分具有很强免疫原性的毒素，却没有或只有很弱的抗原性。毒素抗原性和免疫原性的分离，使得目前使用全蛇毒免疫制备的抗蛇毒血清中还存在没有保护性效价的免疫球蛋白，进一步加重了异源动物蛋白造成了过敏性休克、血清病等严重不良反应的发生。理想的免疫原应该是仅仅包含能够刺激动物产生有效保护性抗体的致病毒素。尖吻蝮蛇是一种广泛分布于我国南方地区的蝰科类毒蛇。其毒性强，毒液量大，受伤患者病情进展快、并发症多、预后差，往往面临截肢或死亡的威胁，是临床治疗中的一大难题。蛇毒金属蛋白酶（snake venom metalloproteinases SVMPs）目前被认为是尖吻蝮蛇等蝰科类毒蛇毒液中含量最丰富、出血活性最强的致病毒素。AaHⅣ是来源于尖吻蝮蛇毒的出血性P-Ⅲ型SVMPs，具有完整的金属蛋白酶结构域（催化结构域）、类去整合素结构域和富含半胱氨酸结构域（非催化结构域），具有明显的出血活性和抑制血小板聚集活性。二、目的和方法为了减少免疫毒素的种类、优化免疫原结构、减少不良反应发生率，我们：1）使用亲和层析和疏水层析等方法，从尖吻蝮蛇粗毒中纯化出天然出血性P-Ⅲ型SVMPsAaHⅣ，并将其作为免疫原，同佐剂一起皮下注射免疫小鼠，3轮免疫后通过间接ELISA法检测抗体效价，确定其是否具有免疫原性；同时，比较使用AaHⅣ免疫小鼠与全蛇毒免疫小鼠产生的抗血清对全蛇毒攻毒的小鼠保护性差异；2）在前部分实验的基础上，采用基因工程技术分别合成AaHⅣ催化结构域和非催化结构域cDNA，并分别重组在pET28a（+）质粒上表，通过工程菌E.coli BL21（DE3）诱导表达；表达产物经Ni2+-NTA亲和层析法进行纯化，并分别使用AaHⅣ、催化结构域片段、非催化结构域片段、PBS免疫小鼠，3轮免疫后通过间接ELLISA法检测其是否具有免疫原型；同时，比较使用AaHⅣ催化结构域片段、非催化结构域片段免疫小鼠与使用AaHⅣ免疫小鼠产生的抗血清对AaHⅣ攻毒的小鼠保护性差异。三、结果1、天然AaHⅣ蛋白纯化经过离子亲和层析和疏水层析，以及脱盐等步骤，成功从江西产尖吻蝮蛇粗毒中纯化到出血性P-Ⅲ型SVMPAaHⅣ蛋白，皮下注射昆明小鼠证明其具有出血活性，并通过BLISS法测定其LD50为10.07μg/g。2、AaHⅣ催化结构域和非催化结构域表达及纯化根据Genebank中查询到的AaHⅣ催化结构域和非催化结构域mRNA序列，进行密码子最优化后，通过基因合成的方法分别获得AaHⅣ催化结构域和非催化结构域cDNA，并重组在pET28a(+)表达质粒上。经CaCl2法转入工程菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导分别表达出AaHⅣ催化结构域片段和非催化结构域片段。AaHⅣ催化结构域片段表达形式为包涵体，经8mol/L尿素溶液溶解，采用His标签纯化，脱盐后得到AaHⅣ催化结构域片段；AaHⅣ非催化结构域片段表达形式为可溶蛋白，表达产物经Ni2+-NTA亲和层析法纯化，脱盐后得到AaHⅣ非催化结构域片段。3、抗体效价分别使用同批次江西产尖吻蝮蛇毒、AaHⅣ蛋白、AaHⅣ催化结构域片段、AaHⅣ非催化结构域片段、PBS，对昆明小鼠进行腹股沟皮下免疫，首轮免疫使用完全弗氏佐剂，后两轮免疫使用不完全弗氏佐剂。3轮免疫后1周通过尾静脉采血，间接ELISA法提示尖吻蝮蛇毒免疫组、AaHⅣ免疫组、AaHⅣ催化结构域片段免疫组、AaHⅣ非催化结构域片段免疫组小鼠均能产生高效价IgG抗体。4、出血抑制实验小鼠3轮免疫后摘眼球取血，分离血清，将尖吻蝮蛇毒免疫组、AaHⅣ免疫组和PBS免疫组抗血清分别与尖吻蝮蛇毒混合（5μl：1μg），37℃孵育1小时后注射未免疫小鼠背部皮肤皮下。24小时后测量小鼠皮下出血面积（n=6）：AaHIV免疫组为（44.83±19.48）mm2，尖吻蝮蛇毒免疫组为（1.50±3.67）mm2，PBS组为（134.83±21.97）mm2。经one way-ANOVA方法进行统计学分析，AaHⅣ免疫组和尖吻蝮蛇毒免疫组皮下出血面积之间有统计学差异（P＜0.001），而AaHⅣ免疫组与PBS组之间皮下出血面积也有统计学差异（P=0.001）。小鼠3轮免疫后摘眼球取血，分离血清，将AaHⅣ免疫组、催化结构域免疫组、非催化结构域免疫组和PBS免疫组抗血清分别与新鲜纯化的AaHⅣ混合（5μl：1μg），37℃孵育1小时后注射未免疫小鼠背部皮肤皮下。24小时后测量小鼠皮下出血面积（n=6）：AaHⅣ免疫组为（2.83±4.92）mm2，催化结构域免疫组为（5.67±6.74）mm2，非催化结构域免疫组为（16.50±11.04）mm2，PBS组为（52.50±16.94）mm2。经oneway-ANOVA统计学分析，AaHⅣ免疫组、催化结构域免疫组、非催化结构域免疫组均较PBS组显著减少出血面积（P＜0.001）；AaHⅣ免疫组与催化结构域免疫组之间无统计学差异（P＞0.05），而与非催化结构域免疫组之间存在统计学差异（P＜0.05）；5、攻毒实验新鲜配置的尖吻蝮蛇毒溶液2LD50剂量采用腹腔注射的方法对尖吻蝮蛇毒组小鼠、AaHⅣ组小鼠和PBS组小鼠进行攻毒。24小时后AaHⅣ免疫组死亡3只，尖吻蝮蛇毒免疫组死亡1只，PBS组全部死亡（n=10）。Fisher’s Exact test方法统计分析提示，尖吻蝮蛇毒免疫组和AaHⅣ免疫组小鼠死亡率没有统计学差异（p=0.58）。尖吻蝮蛇毒免疫组和AaHⅣ免疫组小鼠均与PBS组之间存在统计学差异（p＜0.01）。新鲜纯化的AaHⅣ蛋白2LD50剂量采用腹腔注射的方法对AaHⅣ、AaHⅣ催化结构域片段和非催化结构域片段和PBS组小鼠进行攻毒。24小时后AaHⅣ免疫组存活9只，催化结构域片段免疫组存活8只，非催化结构域片段免疫组存活2只，PBS组存活0只（n=10）。AaHⅣ免疫组和催化结构域片段免疫组小鼠死亡率无统计学差异（P＞0.05）。催化结构域片段免疫组和非催化结构域片段免疫组之间(p＜0.05)，非催化结构域片段免疫组与AaHⅣ免疫组之间（P＜0.001）均存在统计学差异。四、结论①AaHⅣ具有免疫原性和抗原性，其免疫小鼠产生的抗体能够具备对尖吻蝮蛇粗毒的中和活性，可以作为制备抗蛇毒血清的备选免疫原。②AaHⅣ催化结构域片段在P-Ⅳ型SVMPs致病机制中具有重要作用，显示出明确的免疫原性和抗原性，其抗血清能够对小鼠产生与抗AaHⅣ血清一样的中和保护性，可以作为进一步优化免疫原结构的组成部分。