类风湿性关节炎（RA）是一种慢性系统性自身免疫性疾病,其特征是慢性炎症导致的组织损伤、功能障碍、严重残疾和过早死亡。RA的致病机理复杂,一般认为遗传、环境和激素等因素对其影响较大。RA的遗传性为65%,在女性中较男性更为普遍（男女发病率为1:3）。目前,RA尚无明确的治疗标准,该疾病的管理有赖于早期诊断和积极治疗。了解RA相关分子的分子特征有助于更好地理解其发病机制、开发新的诊断和治疗策略。既往研究广泛探讨了基因组、转录组和蛋白质组表达水平的变异在RA发病机制中的作用,并评价了这些变异作为生物标志物的潜力。然而,这些研究大多都是分别在单个组学水平上进行分析。鉴定重要的表观遗传学修饰、靶基因及其相互作用网络有助于更好地理解RA发病机制中涉及的分子通路。本研究旨在鉴定RA相关基因及其功能机制,确定RA发病相关的（表观）遗传学因子以及构建表观遗传学调控网络。本文第一部分,利用同一组RA病例和对照样本外周血单个核细胞（PBMCs）的多组学数据集（转录组mRNA表达数据、全基因组SNP基因分型数据、表观遗传组miRNA表达数据和DNA甲基化数据）,鉴定与RA相关的（表观）遗传因子调控网络和基因共表达调控网络。第二部分,基于定量蛋白质组学技术,系统鉴定潜在的RA蛋白生物标志物。第三部分,通过整合转录组和蛋白质组数据,鉴定与RA相关的基因。关键基因通过RT-PCR和ELISA验证后,进一步通过细胞功能实验明确其对RA相关免疫细胞行为的影响。第一章研究目的在PBMCs中鉴定与RA相关的（表观）遗传因子和基因,构建RA相关基因的（表观）遗传调控网络。研究方法通过利用来自RA病例及对照样本的PBMCs的多组学数据（mRNA、miRNA和DNA甲基化）,鉴定在病例和对照组之间存在显著表达差异的mRNA（DEMs）、miRNA（DEMis）和差异甲基化位点（DMPs）。分别运用Pearson相关分析和因果推断分析（CIT）来鉴定与DEMs显著相关的表观遗传因子（DMPs和DEMis）、确定与RA有因果关系的表观遗传因子和中介基因。采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）对中介基因进行功能注释、识别与RA相关的关键基因。利用全基因组SNPs数据和转录组mRNA表达数据进行了全基因eQTL分析,同时利用公共数据库鉴别不同组织细胞（淋巴细胞、单核细胞、肝脏和大脑）中与PBMCs中共有的eQTL。对于感兴趣的eQTL,采用等位基因表达不平衡实验法（AEI）进行验证。研究结果在PBMCs中共鉴定了 181个DEM（差异倍数>2.0,Bonferroni校正后P<0.05）。在这些DEM中,分别有50个和24个DEM与DMPs和DEMi显著相关（P<0.05）,6个DEM（如CRKL和SMURF1）同时受DMPs和DEMi调控。CIT分析确定了 18条 DMP-DEM-RA 因果关系链,表明 16 个基因（如 SOCS3、CISH、L2HGDH,PARP9和BTN2A1）中介了 DMP和RA之间的关联效应,这些中介基因富集在“蛋白激酶抑制活性”（GO:0004860,P=0.04）等生物过程上。WGCNA表明,中介基因BTN2A1与其它9个中介基因和11个已知的RA相关基因共表达,在共表达网络中起关键作用。此外,我们还构建了一个在转录组范围的遗传因子调控表达网络,鉴定了 28个多效eSNP和18个受双重模式（正式和反式）调控的基因。在PBMCs中鉴定的8,904个eQTL中,仅少数（163个）在淋巴细胞、单核细胞、肝脏和大脑中存在效应。其中,2个cis-eSNP的调控效应被AEI实验所证实。研究结论多组学数据整合研究发现了在PBMCs中的一簇共表达基因受表观遗传因子调控,参与RA的发病。CIT分析鉴定的具有因果效应的DMP,如:cg23371570,中介基因,如:BTN2A1和SOCS3,可作为RA的潜在生物标志物。本研究全面展示了 PBMCs的遗传因子表达调控网络,为理解PBMCs相关的免疫学疾病的发病机制提供了新的见解。第二章研究目的在RA病例对照样本中鉴定潜在的RA蛋白质生物标志物,并评估其在鉴别RA病例和对照中的潜在应用价值。研究方法利用非标定量蛋白质组学技术,在RA病例和对照组样本的PBMCs中筛选RA相关显著差异表达蛋白质,并在独立样本中进行Western blot验证。采用ELISA方法对血浆中关键蛋白质的浓度进行定量,并评价其在鉴别RA病例和对照中的评判价值。研究结果研究共鉴定了 64个差异表达蛋白（P<0.05）,这些差异表达蛋白富集的生物过程包括“SIK/NF-κB信号转导阳性调节”（P=0.018）,“中性粒细胞趋化性阳性调节”（P=0.032）,“吞噬作用阳性调节”（P=0.037）,以及白细胞跨上皮迁移显著富集（KEGG ID 04670）。其中,ITGA2蛋白在RA患者的PBMCs中表达上调,并在独立样本中得到验证。另一个独立样本的ELISA实验显示:RA患者血浆中ITGA2蛋白的表达显著上调。血浆ITGA2蛋白作为RA疾病的潜在评判指标,对RA具有较好的判别能力（AUC=0.80,P<0.05）。研究结论ITGA2蛋白可作为RA诊断的一种新的蛋白生物标志物。第三章研究目的双组学（转录组和蛋白质组）鉴定RA相关基因,明确其表观调控因子和分子功能机制。研究方法基于PBMCs的双组学（转录组和蛋白质组）基因表达数据,在RA病例和对照组样本（25例RA和18例对照）中鉴定RA相关基因,再在独立样本（35例RA和35例对照）中验证最显著的差异表达基因（DEG）。其中,RPN2,经独立样本验证随RA表达显著上调。利用同一批发现样本的PBMCs全基因组SNP基因分型数据、miRNA表达数据和DNA甲基化数据,评估了 RPN2与SNP（eQTLs和pQTLs）、miRNA和DNA甲基化位点（DMPs）之间的关联,并构建了 PBMCs中RPN2基因的表达调控网络。通过RT-PCR实验进一步探究了病例对照样本的原代T细胞内RPN2基因的表达情况。细胞功能实验确定了其对RA相关的免疫细胞（T细胞）行为的影响。最后,通过ELISA及ROC分析对其鉴别RA病例和对照的价值进行评价。研究结果本研究在PBMCs中总共鉴定了 22个DEG（P<0.05）。最显著的DEG,即,RPN2,经独立样本验证实验证实在RA的PBMCs中表达显著上调（P=0.04）。研究构建了PBMCs中RPN2基因的表达调控网络,包括38个eQTL和53个pQTL SNPs,3个miRNAs和2个DMPs。研究还发现,在RA患者的T淋巴细胞和PHA刺激后的Jurkat T细胞中,RPN2的表达也存在显著上调。RPN2在Jurkat T细胞中过表达后,T细胞凋亡受到抑制,细胞增殖和活化增强。此外,PBMCs中的RPN2mRNA和血浆中的RPN2蛋白在鉴别RA病例和对照组中分别表现出较好和一般的能力（P<0.05）。研究结论RPN2基因影响T淋巴细胞的生长和活化,参与RA的发病。RPN2表达受到表观因子的调控。该基因可作为RA诊断的一种新的生物标志物。