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目的结直肠癌(colorectal cancer,CRC)已经成为第三常见的恶性肿瘤及癌症相关死亡的主要原因之一。研究表明随着炎症性肠病患者病史的延长,CRC患病率明显升高,即结肠炎相关肠癌(colitis-associated cancer,CAC)。除肠道炎症外,参与CAC发病的因素还包括免疫反应、表观遗传学的改变及肠道菌群失调。肠道菌群失调促进多种肠道疾病的发生,同时也影响胆汁酸代谢。胆汁酸在肠道菌群作用下发生去结合、氧化、7α-脱羟基化、酯化和脱硫等代谢过程,并参与维持胆固醇代谢、营养物质的消化吸收以及机体代谢稳态。胆汁酸还可以激活胆汁酸受体法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)及G蛋白偶联胆汁酸受体-1(G protein-coupled bile acid receptor 1,TGR5),FXR及TGR5具有调节肠粘膜屏障、肠道炎症及菌群组成的作用。本研究构建CAC模型,旨在探索肠道菌群失调与胆汁酸代谢紊乱在肠道肿瘤进展中的作用,为肠道肿瘤的治疗提供新的思路。方法SPF级7周龄雌性C57BL/6小鼠20只,随机分为对照组和炎癌组。适应环境1周后,第0周留取两组小鼠的粪便用于菌群检测。实验第1天,炎癌组于腹腔注射10mg/kg氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM),对照组腹腔注射0.9%生理盐水作为对照。分别于实验第8-12天、27-31天及46-50天给予炎癌组5天1.5%葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)饮用水,每次DSS饮水后给予2周无菌饮用水,对照组始终给予无菌饮用水。每天密切观察小鼠饮食饮水、排便及一般情况,每周末记录小鼠体重。第10周末,收集小鼠粪便后处死小鼠。量取结肠长度,并记录脾重。纵行剖开肠段后,于解剖显微镜下观察肠道肿瘤分布、数量及大小情况。留取部分结肠,保存于10%福尔马林溶液中以备石蜡包埋。将结肠及小肠组织冻存于-80℃冰箱,用于后续实验。(1)蜡块组织切片后,进行HE染色评估肠道炎症情况及肠道肿瘤癌变程度。(2)Realtime-PCR方法检测小鼠结肠组织炎性细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α表达情况。(3)采用Realtime-PCR方法检测结肠组织紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin1及Claudin3的mRNA水平。(4)采用16S rRNA高通量测序方法检测两组小鼠第0周及第10周末粪便菌群的组成。对原始数据进行质控后,将相似度达97%的Reads进行聚类获得操作分类单元(Operational Taxonomic Units,OTUs)。与16S数据库对比,对每个OTU进行物种分类。运用QIIME统计方法对炎癌组及对照组进行Alpha多样性及Beta多样性分析。(5)采用液相色谱-质谱联用技术检测粪便胆汁酸水平。样本经预处理后,根据质谱仪分析结果绘制标准曲线,通过曲线峰面积计算出每个样本胆酸、鹅去氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸及鼠胆酸的浓度。(6)采用Realtime-PCR方法检测小鼠回肠末端组织FXR、成纤维细胞生长因子15(fibroblast growth factor 15,FGF15)及胆汁酸转运载体顶端钠依赖性胆汁酸转运体(apical sodium-dependent bile acid transporter,ASBT)、有机溶质转运体(organic solute transporter alpha-beta,OSTα-OSTβ)的mRNA水平。Realtime-PCR及免疫组化方法检测结肠组织TGR5的表达水平。结果炎癌组小鼠给予DSS饮水期间体重下降明显且观察到血便,结肠可见多个肿瘤。对照组未观察到便中有血及肿瘤形成。AOM/DSS处理后小鼠结肠出现严重炎症反应,且肠粘膜屏障受到破坏,表现为炎性细胞因子表达增多,紧密连接蛋白表达减少。与对照组相比,炎癌组菌群物种多样性及丰度减少,门水平Bacteroidetes丰度下降,Firmicutes升高;属水平上,炎癌组致病菌螺杆菌属及链球菌属表达增多,产短链脂肪酸菌Lachnospiracea_incertae_sedis、Alistipes及Odoribacter表达下降,表明CAC发展过程中有益菌减少,致病菌表达增多。此外,炎癌组参与胆汁酸代谢的梭菌亚群XlV及乳酸菌属表达下降,表明炎癌组胆汁酸去结合、转化及脱硫能力下降,表现为粪便中游离胆汁酸水平下降,初级胆汁酸向次级胆汁酸转化的能力降低。CAC模型中FXR-FGF15信号轴下调,结肠肿瘤部位TGR5的表达增多。结论CAC发展过程中,肠道菌群失调影响胆汁酸的代谢与组成,导致具有抗炎作用的次级胆汁酸表达减少,在胆汁酸受体的共同作用下促进肠道肿瘤进展。