论文部分内容阅读
辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)广泛应用于废水处理、生物传感和酶联免疫吸附分析(Enzyme linked immunosorbent assay, Elisa)等领域,HRP的性质、抗逆性以及抗逆性保护剂的研究具有重要意义。为了提供性质优良的HRP,同时提供保护HRP稳定性的方法,本文从辣根根茎中提取纯化辣根过氧化物酶(HRP-DL)。考察HRP-DL的酶性质；考察HRP-DL在各种逆环境下的稳定性,同时利用内源荧光光谱分析技术探讨HRP-DL热稳定性与结构的关系。考察渗透压补偿溶质类物质对HRP-DL稳定的保护作用。论文还探讨了渗透压补偿溶质对Elisa测定中HRP稳定性保护作用。HRP-DL的最适作用温度为30℃,最适作用pH为5.5。NaCl对HRP-DL活性有显著的抑制作用,随NaCl浓度升高,HRP-DL残余酶活性显著降低。金属离子浓度为5mmol/L的Ca2+、Mn2+、Zn2+、Pb2+、Mg2+对HRP-DL酶活性呈不同程度的激活作用；而浓度为0.01mmol/L的Cu2+和Hg2+、0.001mmol/L的Ag+、4mmol/L的Fe2+对HRP-DL酶活性呈不同程度的抑制作用。HRP-DL在≥35℃热处理下残余酶活性下降；当HRP-DL在60℃热处理15min添加1.5mmol/L Hectoine (1,4,5,6-四氢-2-甲基-5-羟基-4嘧啶羧酸,1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-5-hydroxy-4-pyrimdine carboxylic acid, Hydroxyectoine)时,HRP-DL残余酶活性提高了14.43%,内源荧光光谱分析表明,热处理导致HRP-DL内源色氨酸暴露、结构改变导致残余酶活性降低,而添加Hectoine对维持HRP-DL热处理下的结构稳定性具有显著作用；在高渗透压(含3%NaCl溶液)下,添加Hectoine对HRP-DL的稳定性具有保护作用,其相对酶活性比未添加时提高了43.84%。将渗透压补偿溶质ectoine (1,4,5,6-四氧-2-甲基-4-嘧啶羧酸,1,4,5,6-tetrahydro-2-methy1-4-pyrimdine carboxylic acid)用于氯霉素Elisa试剂盒的检测中,在高温(40-C)检测中,添加热稳定剂ectoine,其OD450比未添加时提高了28.3%,保护HRP热稳定性,提高氯霉素Elisa试剂盒在高温干扰下的测定准确性。在Elisa试剂盒检测时的抗原抗体结合过程中,添加3%NaCl作为抗原抗体结合的干扰因素,导致OD450值下降了51.58%,干扰了检测的准确性：添加ectoine作为保护剂,使OD450比未添加时提高了26.19%,对抗原抗体结合具有促进作用,降低了盐分的干扰,提高了Elisa检测的准确性。