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众所周知,RNA分子在生物体内具有重要的生物学功能,而对RNA分子的实时监测可以帮助我们了解RNA在细胞中的合成、转运等过程中复杂的动态变化,从而更好地研究RNA参与的生命活动。荧光RNA适配体是近些年来发展的一种简单有效的RNA分子荧光标记工具,已经被广泛地应用于RNA的活细胞成像。HBC（（4-（（2-羟乙基）（甲基）氨基）-亚苄基）-氰基苯乙腈）是基于绿色荧光蛋白GFP的荧光团HBI（4-羟基亚苄基咪唑啉酮）开发的一种新型染料配体。通过SELEX（指数富集的配体系统进化）技术体外筛选得到的Pepper适配体可以特异地结合HBC并激活其荧光。我们采用X-射线晶体学的方法解析了Pepper-HBC复合物的三维空间结构,晶体分辨率为1.64（?）。Pepper-HBC复合物由3个双螺旋P1、P2和P3,内环L1,凸环L2和发卡环L3组成,整体结构呈音叉状。L2和L1以及P2形成远距离相互作用,帮助维持整体三维结构的稳定。配体HBC以近平面构象堆叠于L1的四碱基平面和P2的碱基对之间,并由碱基对G9-C33从侧面固定。体外荧光实验进一步验证了结构上观察到的关键核苷酸对Pepper适配体结合染料配体HBC的重要性。同时,我们也探究了不同的金属离子对Pepper适配体结合并激活HBC荧光的影响。此外,我们还解析了Pepper适配体与6种HBC类似物的复合物结构。Pepper适配体与HBC类似物的复合物整体结构和配体结合口袋的折叠都与Pepper-HBC复合物相似,进一步揭示了Pepper适配体与配体之间的结合机制。R8适配体是基于另一类新型染料配体RFP体外筛选得到的荧光RNA适配体。我们将R8适配体与配体RFP共同孵育进行晶体筛选,获得了1.60（?）的高分辨率晶体,并解析得到R8-RFP复合物的结构。R8-RFP复合物整体结构呈纺锤形,由两个双螺旋茎区P1和P2,连接P1和P2的区域J12以及发卡环L2组成。茎区P1和P2同轴堆积,J12与P1形成远距离相互作用,维持整体结构的稳定性。配体结合口袋位于R8-RFP复合物整体结构的中间位置,配体RFP的3个芳香环处于同一平面,并插入P1的三碱基平面与P2的碱基对之间。基于结构与体外荧光实验,我们对R8适配体的RNA序列进行优化,设计了串联R8。同时,我们也解析了串联3个染料配体结合口袋的III＿R8与配体RFP复合物的结构,进而确定了大小为24 nt的可结合并激活配体RFP荧光的适配体模块。此外,我们根据配体RFP在R8-RFP复合物中的构象,对染料配体进行改造,设计了5种具有不同激发光与发射光的RFP类似物。并解析了R8与这些配体类似物的复合物结构,深入了解R8适配体识别并结合染料配体的机制。值得注意的是,Pepper-HBC复合物和R8-RFP复合物的结构中都不存在G-四联体结构域,这与大多数有结构研究基础的荧光RNA适配体不同,更有利于Pepper适配体与R8适配体在活细胞中的应用。本研究揭示了Pepper适配体及R8适配体结合染料配体并激发荧光的机制,为进一步改造RNA适配体以获得更佳的光学特性提供了结构基础。