石斛抑癌活性成分的提取及作用机制研究

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肺癌作为我国发病率及死亡率最高的恶性肿瘤,目前的治疗方法不仅治愈率低,而且副作用较大。虽然已有少量的肺癌靶向治疗药物被发现,但是仅适用于特定基因型的病患且疗效有限。因此,寻求并开发新型肺癌治疗药物一直是相关研究的重心所在。  石斛为兰科的一个属,始载于《神农本草经》,具有益胃生津、滋阴清热,润肺止咳等功效。其茎作为中草药使用已有两千年的历史,被誉为“仙草”。目前的研究发现,石斛提取物及其化学成分具有显著的抗癌作用,因此从石斛提取物中寻找新型抗癌成分的研究逐渐受到重视,石斛也成为肺癌治疗新药的一个潜在来源。  为了研究石斛中新型抗癌成分的抑癌作用及其机理,本文以金钗石斛(Dendrobium nobile)和迭鞘石斛(Dendrobium denneanum)为研究对象,首先采用极性不同的溶剂对其成分进行了系统提取,通过CCK-8实验研究了石斛不同极性提取物对人肺癌细胞和正常细胞的抑制作用。之后,采用基于SILAC的定量蛋白质组学研究方法探究石斛“五步法-乙醚提取物”对于肺癌A549细胞蛋白质组的系统影响,同时采用qPCR和Western-blot方法从mRNA和蛋白质层面对定量蛋白质组的结果进行验证并阐述其抑癌机制。最后,采用硅胶柱柱层析及红外光谱相结合的方法从金钗石斛中分离纯化得到对肺癌细胞具有较强抑制作用的L成分。本研究主要研究结果如下:  (1)经石油醚预洗后,金钗石斛和迭鞘石斛的乙醚提取物(本文中称为“五步法-乙醚提取物”)对肺癌细胞的抑制作用均明显高于水、乙醇等其它溶剂的提取物,表明石斛中具有抑癌作用的成分极性较小,应采用极性类似的乙醚进行提取。  (2)金钗石斛和迭鞘石斛的“五步法-乙醚提取物”对人肺癌细胞A549具有明显的抑制作用,同时对人肺正常细胞的影响较小。“五步法-乙醚提取物”作用A549细胞24h后,100μg/mL金钗石斛提取物抑癌率约45%,对正常胚肺细胞MRC-5的抑制率约10%;迭鞘石斛提取物抑癌率约40%,对正常胚肺细胞MRC-5的抑制率约20%。  (3)“五步法-乙醚提取物”作用于A549细胞的定量蛋白质组学实验中,分别检测到了人肺癌细胞的5368个(金钗石斛)和4839个(迭鞘石斛)蛋白。其中,共同上调的蛋白有135个,共同下调的蛋白有17个。通过蛋白的功能分析发现,上调蛋白主要为控制细胞代谢过程和应激反应的蛋白,下调蛋白主要与蛋白质的折叠、降解相关。推测提取物能够过度刺激肿瘤细胞的生长关键蛋白,使这些蛋白过度活跃,导致癌细胞内质网存在大量的未折叠蛋白并使内质网长期超负荷运载从而触发癌细胞的应激反应。应激反应进一步导致细胞内毒性活性氧分子的增多,最终导致癌细胞经由凋亡和自噬多种途径发生死亡。  (4)金钗石斛的“五步法-乙醚提取物”采用硅胶柱层析分离得到的L组分在24h内对A549细胞的抑制率高达97%。以肺癌临床治疗一线化疗药物顺铂为阳性对照,金钗石斛L组分对人三种肺癌细胞A549、NCI-H1650、NCI-H129924h的半抑制浓度IC50分别为20μg/mL、25μg/mL、20μg/mL;顺铂对三种肺癌细胞的IC50分别为12μg/mL、15μg/mL、8μg/mL。可见L组分具有较强的抑制肺癌细胞作用,与顺铂差距并不大。此外,顺铂作为一种剧毒化合物副作用较大,而金钗石斛在安全性方面具备较大优势,因此L组分具有较强的肺癌治疗药物开发潜力。  本文的研究结果不仅有利于石斛抑癌成分的提取及其作用机制研究,同时表明金钗石斛作为一种肺癌治疗药物的潜在来源具有较强的开发价值,对于我国传统中药的现代化研究具有重要的参考意义。
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