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【目的】
1.探讨miR-503与脑梗死患者及内皮功能标志物血管性血友病因子(von Willebrand Factor, vWF)的相关性，检测miR-503在脑梗死患者(不同病程、严重程度、不同亚型)中的水平变化。
2.动物水平研究miR-503对脑梗死及脑内皮细胞功能作用的可能机制。
3.细胞水平探究miR-503对脑内皮功能的影响及作用机制。
【方法】
我们在2016.11至2017.11间与广东医科大学附属医院招募并纳入132名脑梗死患者及81名健康体检者。分别采用RT-PCR法及酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测血浆miR-503及vWF水平，并比较不同病程(超急性期、急性期、亚急性期、慢性期脑梗死)、不同严重程度(轻型、中重型)、不同亚型(TOAST及OCSP分型)脑梗死miR-503水平的差异。同时运用受试者工作特征曲线(ROC)曲线分析miR-503在脑梗死中的诊断价值。在300只雄性C57BL/6J小鼠中构建永久性大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，通过小鼠尾静脉注射含有或不含有miR-503拮抗的急性重型脑梗死患者血浆，来评估miR-503对脑梗死的作用。然后采用改良的神经功能评分(mNSS)评估不同实验组小鼠的情况，使用多普勒血流仪检测小鼠脑血流、氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法检测脑梗死面积，伊文氏蓝染色检测血脑屏障功能，脑水含量法评估脑水肿情况，免疫荧光检测小鼠脑内皮中活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)及凋亡水平。在细胞水平，运用腺病毒转染法在人脑微血管内皮细胞(HBMECs)中构建miR-503过表达及敲减模型，空载体转染作为对照组。FITC法检测细胞屏障通透性，流式细胞仪及Hoechast染色法检测细胞凋亡，流式细胞仪法及免疫荧光法检测活性氧(ROS)及一氧化氮(NO)生成。为探讨miR-503对内皮细胞功能影响的可能机制，蛋白印迹法检测磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化及非磷酸化丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶(pAkt/Akt)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、活化型半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)及B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(bcl-2)蛋白表达，通过PI3K激动剂740Y-P干预，观察miR-503是否通过调控PI3K/Akt/eNOS通路来影响内皮细胞功能。
【结果】
1.脑梗死患者血浆miR-503及vWF水平明显高于对照组，MiR-503水平与vWF正相关。
2.miR-503在超急性脑梗死、急性脑梗死期显著增高，而亚急性、慢性期脑梗死的血浆miR-503水平与对照组相比无统计学差异。
3.血浆miR-503水平与脑梗死的严重程度相关。与对照组及轻型脑梗死相比，血浆miR-503水平在中重型脑梗死中显著增高。
4.血浆miR-503水平与脑梗死亚型相关。根据TOAST分型，大动脉粥样硬化组(LAA)、心源性栓塞(CE)中miR-503水平明显升高，其中LAA组最显著；根据OCSP分型，血浆miR-503水平在完全前循环性脑梗死(TACI)及部分前循环性脑梗死(PACI)中显著升高，且TACI组的升高最显著，后循环梗死(POCI)组及腔隙性脑梗死(LACI)组与对照组相比，无统计学差异。
5.多因素回归分析法显示血浆miR-503水平是脑梗死的独立危险因素。ROC分析中，miR-503及vWF的曲线下面积(AUC)分别为0.796和0.795，与参考值(0.5)相比，具有统计学意义。血浆miR-503及vWF用于诊断脑梗死的最佳阈值是0.014nmol/L(敏感度75.8%，特异度72.8%)及384ng/mL(敏感度74.2%，特异度65%)。
6.急性重型脑梗死患者血浆(ASS)加重脑梗死小鼠的神经功能缺损，增大梗死面积，加重血脑屏障损害，降低脑血流，而ASS中加入miR-503拮抗能改善上述情况。
7.ASS提高小鼠脑内皮凋亡、ROS水平，降低NO水平，下调miR-503表达能降低凋亡、ROS及提高NO水平。
8.MiR-503过表达损害细胞屏障功能，miR-503拮抗改善细胞屏障功能。
9.MiR-503过表达促进人脑微血管内皮细胞(HBMECs)凋亡、促进ROS生成，下调NO水平。MiR-503拮抗能降低HBMECs凋亡及ROS水平，增加NO水平，miR-503可通过调控PI3K/Akt/eNOS通路及调控cleavedcaspase-3、bcl-2的表达来发挥作用。
【结论】
1.血浆miR-503水平可作为脑梗死的潜在的生物标志物。
2.MiR-503通过调控内皮细胞功能在脑梗死中发挥作用。
1.探讨miR-503与脑梗死患者及内皮功能标志物血管性血友病因子(von Willebrand Factor, vWF)的相关性，检测miR-503在脑梗死患者(不同病程、严重程度、不同亚型)中的水平变化。
2.动物水平研究miR-503对脑梗死及脑内皮细胞功能作用的可能机制。
3.细胞水平探究miR-503对脑内皮功能的影响及作用机制。
【方法】
我们在2016.11至2017.11间与广东医科大学附属医院招募并纳入132名脑梗死患者及81名健康体检者。分别采用RT-PCR法及酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测血浆miR-503及vWF水平，并比较不同病程(超急性期、急性期、亚急性期、慢性期脑梗死)、不同严重程度(轻型、中重型)、不同亚型(TOAST及OCSP分型)脑梗死miR-503水平的差异。同时运用受试者工作特征曲线(ROC)曲线分析miR-503在脑梗死中的诊断价值。在300只雄性C57BL/6J小鼠中构建永久性大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，通过小鼠尾静脉注射含有或不含有miR-503拮抗的急性重型脑梗死患者血浆，来评估miR-503对脑梗死的作用。然后采用改良的神经功能评分(mNSS)评估不同实验组小鼠的情况，使用多普勒血流仪检测小鼠脑血流、氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法检测脑梗死面积，伊文氏蓝染色检测血脑屏障功能，脑水含量法评估脑水肿情况，免疫荧光检测小鼠脑内皮中活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)及凋亡水平。在细胞水平，运用腺病毒转染法在人脑微血管内皮细胞(HBMECs)中构建miR-503过表达及敲减模型，空载体转染作为对照组。FITC法检测细胞屏障通透性，流式细胞仪及Hoechast染色法检测细胞凋亡，流式细胞仪法及免疫荧光法检测活性氧(ROS)及一氧化氮(NO)生成。为探讨miR-503对内皮细胞功能影响的可能机制，蛋白印迹法检测磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化及非磷酸化丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶(pAkt/Akt)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、活化型半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)及B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(bcl-2)蛋白表达，通过PI3K激动剂740Y-P干预，观察miR-503是否通过调控PI3K/Akt/eNOS通路来影响内皮细胞功能。
【结果】
1.脑梗死患者血浆miR-503及vWF水平明显高于对照组，MiR-503水平与vWF正相关。
2.miR-503在超急性脑梗死、急性脑梗死期显著增高，而亚急性、慢性期脑梗死的血浆miR-503水平与对照组相比无统计学差异。
3.血浆miR-503水平与脑梗死的严重程度相关。与对照组及轻型脑梗死相比，血浆miR-503水平在中重型脑梗死中显著增高。
4.血浆miR-503水平与脑梗死亚型相关。根据TOAST分型，大动脉粥样硬化组(LAA)、心源性栓塞(CE)中miR-503水平明显升高，其中LAA组最显著；根据OCSP分型，血浆miR-503水平在完全前循环性脑梗死(TACI)及部分前循环性脑梗死(PACI)中显著升高，且TACI组的升高最显著，后循环梗死(POCI)组及腔隙性脑梗死(LACI)组与对照组相比，无统计学差异。
5.多因素回归分析法显示血浆miR-503水平是脑梗死的独立危险因素。ROC分析中，miR-503及vWF的曲线下面积(AUC)分别为0.796和0.795，与参考值(0.5)相比，具有统计学意义。血浆miR-503及vWF用于诊断脑梗死的最佳阈值是0.014nmol/L(敏感度75.8%，特异度72.8%)及384ng/mL(敏感度74.2%，特异度65%)。
6.急性重型脑梗死患者血浆(ASS)加重脑梗死小鼠的神经功能缺损，增大梗死面积，加重血脑屏障损害，降低脑血流，而ASS中加入miR-503拮抗能改善上述情况。
7.ASS提高小鼠脑内皮凋亡、ROS水平，降低NO水平，下调miR-503表达能降低凋亡、ROS及提高NO水平。
8.MiR-503过表达损害细胞屏障功能，miR-503拮抗改善细胞屏障功能。
9.MiR-503过表达促进人脑微血管内皮细胞(HBMECs)凋亡、促进ROS生成，下调NO水平。MiR-503拮抗能降低HBMECs凋亡及ROS水平，增加NO水平，miR-503可通过调控PI3K/Akt/eNOS通路及调控cleavedcaspase-3、bcl-2的表达来发挥作用。
【结论】
1.血浆miR-503水平可作为脑梗死的潜在的生物标志物。
2.MiR-503通过调控内皮细胞功能在脑梗死中发挥作用。