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1目的:当前环境铜污染越来越严重,而铜又是人体内一种必不可少的微量元素在生命活动中发挥着至关重要的作用,但是高浓度铜蓄积于体内对机体的影响尚没引起人们的足够重视,尤其是对女性卵泡发育等卵巢功能的影响人们更是知之甚少。针对这一现象本课题将继续前期的研究,拟研究铜负荷对人类卵巢功能的影响并探索有效的中医药治疗方法。本课题将继前期的实验,主要通过在体小鼠动物实验和人的颗粒细胞体外培养实验,观察重金属铜对卵巢颗粒细胞凋亡的影响及ERK1/2信号通路在其中的作用机制,阐明补肾化痰祛瘀中药的作用机制,为治疗铜负荷导致的女性卵泡发育障碍等与卵巢功能相关的疾病提供理论依据和作用靶点,也让人们重视铜污染对女性卵巢功能的影响。2方法2.1在体小鼠动物实验将30只雌性小鼠随机地分为3组:铜负荷模型组、补肾化痰祛瘀方组和正常对照组,每组10只。补肾化痰祛瘀方组与铜负荷模型组的小鼠每天铜溶液灌胃按铜浓度100mg/kg体重,灌胃的体积为0.2ml药液每10g的体重;正常对照组的小鼠每天等体积的生理盐水灌胃;均是每天上午同一时间灌胃1次。在给铜的第15天,开始给小鼠灌胃给药,灌药量为0.2ml药液每10g小鼠体重,每日下午同一时间灌胃1次;铜负荷模型组与正常对照组分别每天等体积的生理盐水灌胃;至给铜的第28天结束。在相应时间点小鼠断颈处死后取双侧卵巢组织做成石蜡切片。Tunel法观察颗粒细胞凋亡;western blot法检测ERK1/2及P-ERK1/2,观察ERK1/2磷酸化的水平。2.2体外培养实验将体外培养的人的颗粒细胞分为:空白对照组、铜负荷组、补肾化痰祛瘀方组,补肾化痰祛瘀+U0126组,进行相应的培养处理;Tunel法观察颗粒细胞凋亡;western blot法检测ERK1/2及P-ERK1/2,观察ERK1/2磷酸化的水平。3结果3.1在体动物实验结果与正常对照组相比,铜负荷模型组小鼠卵巢颗粒细胞凋亡细胞数目增多,凋亡率升高(P<0.05);与铜负荷模型组相比,补肾化痰祛瘀方组小鼠卵巢颗粒细胞凋亡细胞数目减少,凋亡率降低差异(P<0.05)。与正常对照组相比,铜负荷模型组小鼠P-ERK1/2表达量降低(P<0.05);与铜负荷模型组小鼠相比,补肾化痰祛瘀方组小鼠P-ERK1/2表达量相对升高,差异有统计学意义(P<0.05)。3.2体外颗粒细胞培养实验结果与正常对照组相比,铜负荷组人卵巢颗粒细胞凋亡细胞数目增多,凋亡率升高(P<0.05);与铜负荷组相比,补肾化痰祛瘀方组人卵巢颗粒细胞凋亡细胞数目减少,凋亡率降低差(P<0.05);与补肾化痰祛瘀方组相比,补肾化痰祛瘀方+U0126组的人卵巢颗粒细胞凋亡细胞数目显著增多,凋亡率升高(P<0.05);与正常对照组相比,铜负荷组人卵巢颗粒细胞P-ERK1/2表达量相对降低(P<0.05);与铜负荷组相比,补肾化痰祛瘀方组人卵巢颗粒细胞P-ERK1/2表达量相对升高,差异有统计学意义(P<0.05)。4结论4.1铜负荷可促使卵巢颗粒细胞凋亡;4.2补肾化痰祛瘀方可抑制铜负荷卵巢颗粒细胞的凋亡;4.3铜负荷可使卵巢颗粒细胞ERK1/2的磷酸化受到抑制;4.4补肾化痰祛瘀方可促进铜负荷卵巢颗粒细胞ERK1/2磷酸化激活;4.5过量的铜可能通过抑制卵巢颗粒细胞ERK1/2磷酸化的激活,进而促进颗粒细胞凋亡,影响卵泡的生长发育等卵巢生理功能;4.6补肾化痰祛瘀方可能通过促进铜负荷卵巢颗粒细胞ERK1/2磷酸化激活,进而抑制其凋亡,从而促进铜负荷卵泡的生长发育等卵巢生理功能。