【摘 要】
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DNA甲基化酶能够将供体上的甲基转移至目的DNA的特定识别位点上,是实现DNA甲基化修饰的重要组成部分。甲基化酶M1.BsaⅠ和M2.BsaⅠ与限制性内切酶BsaⅠ组成限制-修饰系统,M1.BsaⅠ和M2.BsaⅠ与BsaⅠ重叠的识别序列可作为体内甲基化的可转化开关。通过控制开关使基因内部特定位点甲基化,目的基因可以根据需要组装至特定位点。因此,对M1.BsaⅠ和M2.BsaⅠ的研究显得尤为重要。
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DNA甲基化酶能够将供体上的甲基转移至目的DNA的特定识别位点上,是实现DNA甲基化修饰的重要组成部分。甲基化酶M1.BsaⅠ和M2.BsaⅠ与限制性内切酶BsaⅠ组成限制-修饰系统,M1.BsaⅠ和M2.BsaⅠ与BsaⅠ重叠的识别序列可作为体内甲基化的可转化开关。通过控制开关使基因内部特定位点甲基化,目的基因可以根据需要组装至特定位点。因此,对M1.BsaⅠ和M2.BsaⅠ的研究显得尤为重要。M1.BsaⅠ和M2.BsaⅠ表达强度和酶活将直接影响DNA甲基化水平,对其表达与功能的研究,将为BsaⅠ-M.BsaⅠ的DNA组装系统的建立提供基础。本课题研究的是嗜热脂肪芽孢杆菌中BsaⅠ的甲基化酶M1.BsaⅠ和M2.BsaⅠ的表达与功能,主要内容和结果如下:将M1.BsaⅠ和M2.BsaⅠ构建至pBR322载体,在载体N端添加His6标签,并在大肠杆菌进行了诱导表达,经Ni-TAT纯化和分子筛纯化后获得重组蛋白M1.BsaⅠ和M2.BsaⅠ。对M1.BsaⅠ和M2.BsaⅠ进行酶活动力学的研究,确定M1.BsaⅠ最适酶活反应温度为55℃,最大反应速率为0.24 μM·s-1,米氏常数为0.596 μM,催化常数为8.51 s-1,酶的比活力为12.05 U/mg;M2.BsaⅠ最适酶活反应温度为50℃,最大反应速率为0.33 μM·s-1,米氏常数为1.05 μM,催化常数为7.08 s-1,酶的比活力为13.51 U/mg。对M2.BsaⅠ进行结构模拟得到活性位点和配体结合位点,对野生型进行丙氨酸定点突变的改造,重新构建了pHisC-M2.BsaⅠ的E.coli表达系统,实现体内酶活的检测,将突变体与野生型的体内酶学性质进行比较,确定其活性位点为245位点谷氨酸,配体结合位点分别为134位点甘氨酸和154位点天冬氨酸。
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