论文部分内容阅读
目的：近年来研究显示，microRNAs（miRNAs）在细胞生存的基因调控中发挥着举足轻重的作用。凋亡，一个主动的细胞死亡程序，受miRNAs调控，这一过程存在于多种人类疾病中如心脏病，并且被视为潜在治疗靶点。丹参酮IIA(TIIA)，菲醌类单体，被广泛用于心血管疾病中，具有瞩目的心肌保护作用；在缺血性心脏病中，TIIA能够通过上调Bcl-2的表达而发挥其抗凋亡作用。本课题拟探讨miRNAs是否参与TIIA抗心肌细胞凋亡机制，为寻求最佳治疗靶点提供理论依据。
方法：1、通过以下七个数据库进行miRNA与靶基因匹配位点预测，包括DIANA-microTv3.0、miRanda、MirTarget2、MicroCosm、PicTar、PITA和TargetScan;2、通过MTT法检测细胞存活率，ELISA检测断裂DNA含量；3、通过体外细胞转染技术，验证miR-34与抗凋亡基因BCL2、BCL2L2、TCL1、API5的调节作用；4、通过实时定量RT-PCR法检测心肌细胞应激状态时miR-34以及BCL2、BCL2L2、API5、TCL1的mRNA水平；5、通过Western blot检测Bcl-2、Bcl-w、Api蛋白水平;6、通过双荧光素酶报告基因检测miR-34对靶基因BCL2、BCL2L2、TCL1、API5的靶向调节作用；7、实验数据以X±S.E.表示，采用多个样本均数间的多重比较Dunnett-t检验进行统计，应用GraphPad Prism进行非线性拟合。
结果：阿霉素或H202刺激大鼠乳鼠原代培养心室肌细胞24h后，miR-34家族(miR-34a、miR-34b、miR-34c)水平均显著上调，这一结果明显加重心肌细胞凋亡；AMO-34b可以逆转上述结果；同时预先给予TIIA能够显著下调miR-34并且减轻凋亡；除此以外，miR-34能显著抑制靶基因BCL2、BCL2L2、TCL1和API5的表达，但对其mRNA水平无明显影响。
结论：通过对上述蛋白编码的抗凋亡基因的抑制提示在应激状态下miR-34具有显著的促进心肌细胞凋亡作用，而丹参酮IIA能够逆转这一过程；因此，通过抑制miR-34表达而上调Bcl-2及其它抗凋亡蛋白，是TIIA的抗心肌细胞凋亡可能机制之一，进而发挥其保护心肌缺血损伤作用。