论文部分内容阅读
背景:随着重度溃疡性结肠炎(severe ulcerative colitis,SUC)发病率与病死率的不断攀升,以及其发病急、进展快的特点,SUC已逐渐成为临床关注的重点。糖皮质激素是目前公认治疗SUC的最主要药物,但不同的患者对激素治疗有着不同的临床药物反应,部分患者存在激素抵抗。据有关报道显示糖皮质激素治疗总有效率为70%,约30%的SUC达不到临床缓解,存在糖皮质激素抵抗现象。对于激素抵抗患者往往需要进行药物升级疗法,甚至需要手术治疗,若能提前预测患者对激素的敏感程度则能为临床医生选择不同的治疗方案提供帮助。目前尚缺乏一种可靠的标准提前预知患者对激素治疗的敏感程度,研究显示机体对糖皮质激素敏感与否与异常增多的糖皮质激素受体-β(GR-β)以及与NF-KB信号通路的活性增强有关。骨保护素(osteoprotegerin,OPG)是一种受体蛋白,近年来有学者提出OPG能反应炎症性肠病病变程度、部位、类型,并能预测UC患儿对糖皮质激素的敏感性,有望成为协助炎症性肠病诊疗的新指标。目的:通过检测SD大鼠SUC模型激素治疗前后血清中OPG水平的变化以及结肠组织GR-β基因和NF-KB蛋白的表达,从而探讨OPG能否作为预测SD大鼠结肠炎对激素敏感性的检测指标。方法:60只质量约250-280g的雄性SD大鼠;随机编号为1-60号,采用单笼饲养。TNBS组为1-40号,模型组(M组)为41-50号,对照组(N组)为51-60号。TNBS组和M组均采用5%TNBS+50%乙醇(v/v)溶液建立大鼠急性结肠炎的重症模型,N组采用同等容量的50%的乙醇溶液灌肠。造模成功后的第三天予以干预处理,TNBS组大鼠每日于同一时间予以地塞米松磷酸钠(2mg/kg)腹腔注射1次,共注射10天;M组、N组大鼠按相同计算方法予以腹腔注射生理盐水。每日对大鼠的疾病活动指数(DAI指数)进行评分,分别于造模成功后第3天与第13天取大鼠眼眶静脉血用酶联免疫法(ELISA)检查血清中OPG水平。第13天处死所有大鼠,采集结肠标本行肉眼观结肠病变损害程度(CMDI)评分;取病变结肠组织行HE染色后观察并行病理评分(TDI评分)。据DAI指数变化、TDI以及CDMI评分综合结果将TNBS组分为激素有效组(S组)以及激素无效组(I组)。取病变明显的结肠组织,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测N、M、S、I组结肠组织中的GR-β受体基因表达情况,蛋白NF-KB p65含量的检测由蛋白质印迹法(Western Blot)完成;激素治疗前后OPG变化采用配对t检验完成,GR-β与NF-KB p65分别采用单因素方差分析完成。结果:1、N组结肠组织形态、结构清楚,无炎性细胞浸润,其DAI指数、CDMI及TDI结果均比其他各组得分低,且具有统计学意义(p<0.05);M组DAI指数、CDMI及TDI评分均最高,大鼠可见不同程度的精神、食欲下降、腹泻以及血便,肉眼可见肠粘膜的水肿和坏死,HE染色可见结肠粘膜结构破坏以及炎性细胞的浸润,杯状细胞减少,表明溃疡性结肠炎大鼠模型复制成功。2、ELISA结果:(+表示造模第3天时的血清标本,-表示造模第13天的血清标本)OPG含量在N组最低,M组第3天时的OPG(M+)明显高于其他各组。S组激素治疗后(S-)的OPG含量明显低于治疗前(S+)(p<0.01),然而I组激素治疗前(I+)和治疗后(I-),N组第3天(N+)和第13天(N-)的OPG含量差异无统计学意义(p>0.05)。3、GR-β受体基因表达结果:I组中的GR-β受体基因表达量显著高于其他各组,GR-β表达量在N组最低。除N组与S组之间无差异(p>0.05)外,其余各组之间均有统计学意义(p<0.05)。其中,GR-β基因在I组的表达量明显高于S组。4、NF-KB p65蛋白表达量:M组NF-KB p65蛋白表达最多,N组最少;且I、S、M、N任意两组之间比较差异均具有统计学意义(p<0.05)。其中I组蛋白表达量远远高于S组(p<0.01)。5、ROC曲线分析OPG最佳截断值为1542.9360 pg/ml,ROC曲线下面积为0.910;GR-βROC曲线下面积为0.944,NF-KB p65 ROC曲线下面积为0.891。结论:1、三硝基苯磺酸溶液灌肠法是建立溃疡性结肠炎动物模型较为理想的方法,当TNBS剂量为180 mg/kg时所得到的SD大鼠结肠炎模型可达到重症标准。2、本实验验证了GR-β受体以及NF-KB p65可以间接预测大鼠对糖皮质激素的敏感程度。3、UC大鼠的血清OPG可以间接反映对糖皮质激素治疗的敏感程度,可作为临床激素疗效的检测指标。