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目的天然植物提取物在口腔疾病防治领域应用的研究已引起越来越多的关注,近十年来我们课题组一直从多角度进行有关柠檬精油(lemon essential oil,LEO)等天然植物提取物的防龋研究;柠檬烯(limonene,LIM)为LEO的主要成分;橙皮苷(hesperidin,HPN)也是柠檬提取物(Lemon peel extract,LPE)中的成分,在柠檬精油中含量较低;茶多酚(Tea-Polyphenols,TP)是公认的一类有防龋功效的天然植物提取物。口腔疾病主要分为硬组织损伤和软组织损伤两大类,其中硬组织损伤主要为龋病,变形链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)中的乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)利用碳水化合物代谢产酸,从而引起菌斑内局部p H的降低,造成牙釉质的局部脱矿,龋损形成;在软组织疾病研究方面,有大量文献报道,口腔组织内过多的自由基可引起牙周病的发生,清除局部增加的氧自由基可促进口腔溃疡愈合,促进颌面部损伤创口的愈合。本实验对比研究TP、HPN、LEO及其主要成分LIM对变形链球菌乳酸脱氢酶活力和产酸的抑制作用;研究其对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-trinitrobenzene hydrazine,DPPH·)和羟基自由基(hydroxyl radical,·OH)的清除能力,进一步探讨柠檬提取物在口腔疾病防治中可能的作用机制,为今后开发天然、无毒副作用、新型的生态口腔疾病防治制剂提供理论依据。方法1.测定四种天然植物提取物对S.mutans LDH活性的影响选取S.mutans UA159为实验菌株。首先测定LEO、HPN、LIM、TP对S.mutans的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)。选取MIC浓度下三个浓度作为实验浓度,空白对照组为不加任何药物的BHI液体培养基,采用还原性辅酶Ⅰ氧化法测定四种天然植物提取物对S.mutans LDH活性的影响。2.测定四种天然植物提取物对S.mutans代谢产酸的影响用FE20实验室pH计测定用药前后培养液中pH值的变化(△pH=初始pH值-终末p H值),以检测四种天然植物提取物对S.mutans产酸能力的抑制作用,并对LDH活性和产酸能力做相关性分析。3.测定四种天然植物提取物对自由基的清除作用选取四种天然植物提取物MIC以下三个浓度组作为实验组,采用UV-Vis光谱分析方法,测定TP、HPN、LEO及其主要成分LIM对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)和羟基自由基(·OH)的清除能力。4.采用SPSS17.0软件,将数据输入并进行分析,各组总体均数间的比较应用单因素方差分析(ANOVA);采用Student-Newman-Keuls检验对各样本组间均数进行两两比较;P<0.05定义为差异具有统计学意义。结果1.LEO、HPN、LIM、TP对S.mutans的MIC分别为4.5mg/ml、8mg/ml、23mg/ml、4mg/ml。2.LEO[2.25mg/ml(1/2MIC)~0.563mg/ml(1/8MIC)]、HPN[4mg/ml(1/2MIC)~1mg/ml(1/8MIC)]、LIM[11.5mg/ml(1/2MIC)~2.875mg/ml(1/8MIC)]和TP[2mg/ml(1/2MIC)~0.5mg/ml(1/8MIC)],对S.mutans LDH活性和产酸均有抑制作用,与空白对照组比较,差异有统计学意义(酶活性:FLEO=105.186,P<0.05;FHPN=34.522,P<0.05;FLIM=31.40,P<0.05;FTP=28.209,P<0.05;产酸:FLEO=162.05,P<0.05;FHPN=24.003,P<0.05;FLIM=73.945,P<0.05;FTP=32.006,P<0.05),并随实验溶液浓度升高,作用能力增强;同时,对酶活性和产酸的影响具有一定的相关性,LEO和HPN溶液对S.mutans的作用呈正相关(r LEO=0.963~0.994;r HPN=0.893~0.973),而TP和LIM溶液对S.mutans的作用无相关性(r TP=0.999~0.198;r LIM=0.981~0.115)。3.四种天然植物提取物1/2 MIC浓度组,对其抑制S.mutans培养溶液中LDH活性的能力进行比较,依次为:LEO>LIM>TP>HPN,差异具有统计学意义(F=4.342,P<0.05);对其抑制S.mutans培养溶液中产酸的能力进行比较,依次为:LEO>LIM>HPN>TP,差异有统计学意义(F=5.744,P<0.05)。4.LEO[2.25mg/ml(1/2MIC)~0.563mg/ml(1/8MIC)]、HPN[4mg/ml(1/2MIC)~1mg/ml(1/8MIC)]、LIM[11.5mg/ml(1/2MIC)~2.875mg/ml(1/8MIC)]和TP[2mg/ml(1/2MIC)~0.5mg/ml(1/8MIC)],对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)和羟基自由基(·OH)均有清除能力(DPPH·自由基:FLEO=2249.965,P<0.05;FHPN=47.217,P<0.05;FLIM=21.825,P<0.05;FTP=6.246,P<0.05;·OH自由基:F LEO=99.977,P<0.05;FHPN=15.145,P<0.05;FLIM=9.200,P<0.05;FTP=19.935,P<0.05),并且随TP、LEO、HPN及LIM浓度的增加,清除作用加强。5.四种天然植物提取物对DPPH·自由基的清除能力为:橙皮苷>柠檬精油>茶多酚>柠檬烯(IC50分别为0.097,0.0143,0.0139,0.0024)。对羟自由基的清除能力为:茶多酚>柠檬精油>橙皮苷>柠檬烯(IC50分别为0.0794,0.0133,0.011,0.0040)。结论1.LEO、HPN、TP及LIM四种天然植物提取物均能抑制S.mutans的LDH活性和产酸,且均具有浓度依赖性。作用能力相比较,最强的是LEO。LEO和HPN溶液对S.mutans LDH活性抑制和产酸抑制作用呈正相关。2.LEO、HPN、TP及LIM四种天然植物提取物均能对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)和羟基自由基(·OH)均有清除能力,且均具有浓度依赖性。清除DPPH·的能力,HPN要明显优于其他三组药物;清除·OH的能力,TP要明显优于其他三组药物。柠檬提取物LEO及HPN具有防治龋病及促进口腔软组织创口愈合的能力,与TP相比有一定的优势,是一类有发展前景的可用于防治口腔疾病的天然植物提取物。