[背景及目的]在世界范围内,肝癌仍然是癌症致死的主要原因之一,是第三大致死性癌症,每年的死亡数高达100万。近些年来,虽然肝癌的临床研究取得了很大的进展,但肝癌侵袭、转移的机制目前还尚不完全清楚。随着对肝癌信号转导通路研究研究的不断深入,人们发现肝癌细胞内部的某些转导通路的激活或抑制与肝癌的发生、发展等有着紧密的联系。通过对癌症信号通路的抑制治疗癌症是近年来肿瘤临床治疗方面的重大突破。应用siRNA沉默β-catenin基因及蛋白质的表达,并使细胞周期阻滞于G0/G1期。一次转染可在一定时间内抑制肝癌细胞的生长,在肝癌的治疗中起一定的作用,但不能治愈肝癌。肝癌细胞中β-catenin信号传导通路可以调节肝癌的细胞生长、细胞周期、细胞凋亡、血管生成因子、端粒酶及其它信号通路等,因此抑制β-catenin信号通路在肝癌的治疗中起一定的作用。胎盘特异蛋白8 (PLAC8),又称为onzin8,富含半胱氨酸蛋白,在人类的树突状细胞中首次被发现。PLAC8基因大小近700 bp,其开放阅读框的长度约348 bp,但一些RNA印迹表明在某些器官中其]mRNA长度为4400-7000 bp。PLAC8蛋白分子质量为12.4 kDa,在一些哺乳动物中其信号肽的限制酶结合位点具有相似性,并且氨基酸序列中富含占据10%总长的半胱氨酸,比如,在全长的人PLAC8中,每112个氨基酸就包含15个半胱氨酸；在全长的鼠PLAC8中每115个氨基酸包含16个半胱氨酸。大部分的半胱氨酸形成CXXC结构,形成分子内部的二硫键,该结构是结合其底物的特殊位点。基因组分析表明人PLAC8基因位于染色体4q13-4q21,包含由U2 GT-AG连接的5个外显子。它参与调控癌症,细胞凋亡以及细胞的分化过程。相关报道指出PLAC8是肝癌发生的标记物,但是它在癌症早期高表达,之后其表达水平又逐渐降低。但PLAC8在肝癌发生发展过程中的研究较少,其对肝癌发生到底起抑制作用还是促进作用仍不明确；在癌症中,其具体的作用机制也未见报道,同时,调控PLAC8表达的相关因子也尚未加以研究。本课题旨在检测PLAC8在肝癌发生过程中的表达,并探讨其作用机制,为HCC分子机制的探究寻找新的依据。[方法]一, PLAC8在肝癌中的表达1.肝癌病人肝脏同正常肝脏的PLAC8表达水平检测分别提取肝癌病人肝脏和正常肝脏中的RNA,通过逆转录合成cDNA,应用Real-time PCR检测PLAC8的mRNA表达情况。2.肝癌病人肝肿瘤周围组织和肿瘤组织中PLAC8的mRNA表达水平检测分别提取肝癌患者肝肿瘤周围组织和肿瘤组织中的RNA,通过逆转录合成cDNA,应用Real-time PCR检测PLAC8的mRNA表达情况。3.肝癌病人肝肿瘤周围组织和肿瘤组织中PLAC8的蛋白水平检测对136例肝癌病人的肝肿瘤周围组织和肿瘤组织进行免疫组织化学染色,检测PLAC8蛋白水平的变化情况。4. PLAC8水平对肝癌患者生存率的影响对136例肝癌患者的生存时间进行统计,并对PLAC8水平的高低和生存时间作图。二、PLAC8对肿瘤生长的影响Huh7细胞过表达PLAC8原位接种构建肿瘤模型将过表达PLAC8的Huh7细胞或空载体细胞以1×106/只注射至雌性BALB/c (nu/nu)小鼠肝脏中,4周后处死小鼠,取出肝脏拍照并对肿瘤体积进行统计。三、PLAC8对肝肿瘤细胞生物学特性的影响1.PLAC8对肝癌细胞活力的影响在96孔板中接种细胞悬液,将培养板放在培养箱中预培养。向每孔加入10μL CCK溶液,在培养箱内孵育1-4 h后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。2. PLAC8对肝肿瘤细胞克隆形成能力的影响取对数生长期的各组细胞,分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,并把细胞悬浮在含10%胎牛血清的DMEM培养液中,然后将细胞悬液做梯度倍数稀释。每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度浓度分别接种含10 mL、37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置于37℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2-3周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5 mL,固定15min。然后去固定液,加入适量的GIMSA应用染色液染色10-30 min,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆倍数。3. PLAC8对细胞周期的影响Western blot检测PLAC8对细胞周期相关蛋白Rb和CCND1蛋白水平的影响。四、PLAC8抑制肝肿瘤发生的机制1.PLAC8对Wnt/β-catenin信号通路的影响Real-time PCR检测PLAC8与Wnt信号通路靶基因c-Myc间的相关性；Western blot检测Hep3B细胞中PLAC8与c-Myc在蛋白水平上的相互作用；荧光素酶报告分析检测Hep3B、HepG2细胞中PLAC8对β-catenin的影响。2. PLAC8对Akt/GSK3β/β-catenin信号通路的调控作用Western blot检测Hep3B、HepG2细胞中PLAC8对p-Ak、Akt、p-GSK3β、 GSK3β、β-catenin蛋白水平的影响。五、肝癌发生过程中PLAC8水平下调的机制1. Real-time PCR检测正常肝组织和肝癌组织中miR-185-5p的mRNA水平。2.应用Real-time PCR对PLAC8与miR-185-5p的mRNA水平进行相关性分析。3.荧光素酶报告分析检测Hep3B细胞中miR-185-5p对PLAC8的调控作用。4. Western blot检测Hep3B、HepG2细胞中miR-185-5p对PLAC8的调控作用。5.Huh7细胞中检测miR-185-5p和PLAC8的相互作用对细胞活力的影响。六、统计学处理采用SPSS 17.0进行数据分析,实验数据采用X±s表示,Shapiro-Wilk对数据进行正态分布检验,非正态分布数据进行对数变换。两组间计量资料差异比较采用t检验。计量资料多组间差异用完全随机设计方差分析,根据Levene方差齐性检验,组间两两比较采用LSD检验分析。检验水准α=0.05。[结果]一、PLAC8在肝癌发生、发展过程中表达水平降低1.肝癌中PLAC8 mRNA表达水平显著降低Real-time PCR检测结果显示,同正常肝组织相比,PLAC8的mRNA水平在肝肿瘤组织中显著降低(p<0.0001)。2.肝肿瘤组织中PLAC8 mRNA表达水平显著降低通过对肝癌患者肝肿瘤组织和肝肿瘤周围组织的PLAC8 mRNA水平进行Real-time PCR检测,结果显示PLAC8的mRNA表达在肝肿瘤组织中显著降低(p<0.0001)。3.肝癌病人肝肿瘤组织中PLAC8的蛋白表达水平降低免疫组织化学染色法结果显示,136名肝癌患者中,有84名患者的PLAC8表达水平在肝肿瘤组织中降低,分别有26名患者的PLAC8表达水平在肝肿瘤组织中保持不变或升高。4.低表达水平的PLAC8伴随着肝癌患者存活率的降低生存分析结果显示,低表达水平PLAC8的84名患者存活率相对较低,而高表达水平PLAC8的患者生存率较高(p=0.011)。二、PLAC81印制肿瘤的生长通过构建肝癌小鼠模型,结果显示过表达PLAC8的小鼠肝肿瘤体积显著降低(p<0.01)。三、PLAC8抑制肝肿瘤细胞活力及增殖能力1.PLAC8抑制肝癌细胞的活力荧光素酶报告分析结果显示,在Huh7、SMMC-7721、HepG2、Hep3B四种肝癌细胞系中,过表达的PLAC8抑制了细胞的活力(p< 0.01); PLAC8的抑制使细胞活力得到了恢复(p<0.01)。2. PLAC8抑制肝癌细胞的增殖克隆形成实验结果显示,在Huh7、SMMC-7721肝癌细胞系中,过表达的PLAC8抑制了细胞克隆数量(p<0.001)。3.PLAC8抑制细胞周期进程Western blot检测结果显示,过表达的PLAC8抑制细胞周期相关蛋白Rb蛋白的磷酸化,以及CCND1蛋白的表达。四、PLAC8通过调控Wnt/β-catenin及Akt/GSK3β/β-catenin信号通路抑制肝肿瘤的发生1.PLAC8抑制Wnt/β-catenin信号通路从而抑制肝肿瘤的发生Real-time PCR和Western blot检测结果显示,PLAC8与c-Myc呈负相关；荧光素酶报告分析结果表明,在Hep3B和HepG2细胞中,PLAC8能调控β-catenin使其水平降低。2. PLAC8抑制Akt/GSK3β/β-catenin信号通路进而抑制肝肿瘤的发生Western blot检测结果显示,在Hep3B和HepG2细胞中,PLAC8抑制P-Akt及β-catenin蛋白水平,促进GSK3β蛋白的磷酸化水平。五、在肝癌发生过程中,miR-185-5p抑制PLAC8的表达1.肝癌中miR-185-5p水平显著升高。Real-time PCR检测结果显示miR-185-5p在肝肿瘤组织中显著升高(p<0.0001)。2. miR-185-5p与PLAC8 mRNA水平呈负相关Real-time PCR检测结果显示miR-185-5p与PLAC8的]mRNA水平呈负相关。3.miR-185-5p抑制PLAC8水平荧光素酶报告分析结果表明miR-185-5p抑制PLAC8的表达；Western blot检测结果显示tniR-185-5p下调PLAC8的蛋白表达水平。4.miR-185-5p抑制PLAC8进而增强细胞活力miR-185-5p与PLAC8的相互作用增强了细胞的活力。[结论]1.PLAC8在肝癌的发生、发展过程中,表达水平显著降低。2. PLAC8能抑制肝癌细胞的生长。3. PLAC8对肝癌细胞活力、细胞增殖能力以及细胞周期的进程起到抑制作用。4. PLAC8通过调控Wnt/β-catenin及Akt/GSK3/β-catenin信号通路抑制肝癌的发生。5.miR-185-5p能调控PLAC8的表达水平,下调其表达。