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目的：课题组前期的蛋白质组学研究发现,益气除痰方可明显下调小鼠Lewis肺癌组织GRP78、vimentin的表达,而Vimentin是上皮间质转化(EMT)的关键标志物,推测益气除痰方可能通过下调GRP78来逆转EMT的发生。本研究拟通过建立A549细胞缺氧模型诱导GRP78高表达,构建siRNA靶向干扰GRP78下调作对照,探讨GRP78高表达诱导EMT的作用机制。并采用蛋白特异性抑制剂分别抑制SRC、MAPK、PI3K、AKT、 smad2/3通路的激活,以探究缺氧环境下细胞发生EMT的相关分子机制。同时采用体内外双水平实验,探索益气除痰方下调GRP78抑制EMT发生的作用机制,为揭示缺氧微环境下肿瘤细胞发生EMT的分子机制及中药复方抑制EMT的作用机理提供理论和实验依据。方法：1.细胞实验部分：以我科常用的治疗肺癌方-益气除痰方为工具药,以人肺腺癌A549细胞为靶细胞,运用细胞缺氧培养箱构建A549细胞缺氧模型；Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡；细胞免疫荧光标记方法观察GRP78在细胞中的分布及表达；采用RT-PCR方法从基因水平对EMT相关转录因子(Snail1、Snail2、Twist、ZEB1、ZEB2)进行定量检测；运用Western blot从蛋白水平检测EMT相关标记物(E-cadherin、 vimentin和fibronectin)的表达,并检测GRP78, SRC、MAPK、PI3K、AKT、smad2/3等相关信号蛋白的表达及其磷酸化激活水平。构建GRP78质粒转染A549细胞以沉默GRP78表达,结合SRC、MAPK、PI3K、AKT、smad2/3等蛋白特异性抑制剂的干预作用,探索缺氧微环境下细胞发生EMT的分子机制及益气除痰方逆转EMT的作用机理。2.动物实验部分：构建裸鼠A549肺癌移植瘤模型,造模成功后随机分为空白对照组和益气除痰方组,然后进行灌胃给药。给药期间每3天测量小鼠体重和瘤体体积。给药结束后,测量瘤重,计算抑瘤率；观察肺表面转移结节,计算转移抑制率。应用免疫组化法检测瘤体组织EMT相关标记物(E-cadherim、vimentin和fibronectin)的表达,并检测GRP78及SRC、MAPK、PI3K、AKT、smad2/3等蛋白表达及其磷酸化的表达水平。结果：肺癌A549细胞在缺氧环境培养时,其细胞形态出现明显变化,由扁圆梭形的上皮细胞形态变为明显拉长的纺缍形间质细胞形态。同时代表上皮表型的E-cadherin蛋白表达明显下降,而代表间质表型的vimentin和fibronectin蛋白表达明显升高,EMT相关转录因子(Snail1、Snail2、ZEB1、ZEB2、Twist)的表达也明显上升(P<0.05),提示在缺氧微环境下,A549细胞发生了上皮间质转化。而加入益气除痰方干预后,间质细胞形态的细胞明显减少,细胞纺缍形态的变化程度也明显减轻。同时E-cadherin的下降程度、vimentin和fibronectin的升高程度均较缺氧模型组明显减轻,EMT相关转录因子(Snaill、Snail2、ZEB1、ZEB2及Twist)的表达明显下降(P<0.05),提示益气除痰方可明显抑制缺氧环境下A549细胞EMT的发生。在缺氧环境下A549细胞中GRP78、SRC、MAPK、smad2/3等蛋白表达及其磷酸化水平均明显升高(P<0.05),提示GRP78、smad2/3、SRC、P38、ERK以及JNK等信号蛋白在细胞EMT的发生过程中可能发挥了重要作用。益气除痰方干预后,GRP78、SRC、PI3K、AKT、MAPK、smad2/3等蛋白表达及其磷酸化水平下降(P<0.05),提示益气除痰方抑制细胞EMT的机制可能与多靶点抑制上述蛋白信号通路有关。细胞免疫荧光标记结果显示,缺氧环境下A549细胞中GRP78均匀分布于细胞质中,呈现明显高表达。益气除痰方干预后,GRP78的表达明显下降,.推测GRP78在EMT的发生机制中发挥了重要作用。本研究成功构建了GRP78质粒并转染A549细胞,并通过抗性筛选获得稳定转染的细胞株。应用稳定转染GRP78质粒的A549细胞株沉默GRP78表达,结合smad2/3、 P13K、AKT、SRC、P38、ERK以及JNK等特异性蛋白抑制剂的干预,观察抑制不同信号蛋白对EMT的影响。结果显示,GRP78、smad2/3、SRC、P38、ERK以及JNK等蛋白被抑制后,缺氧环境下A549细胞发生EMT的程度减弱(P<0.05),尤以沉默GRP78时对EMT的影响最明显,smad2/3及SRC受抑时次之,P13K及AKT受抑时,对EMT过程无明显影响。进一步分析显示,沉默GRP78后,与缺氧模型组相比,smad2/3、SRC、P38、ERK、.7NK及其磷酸化蛋白表达下降(P<0.05),而PI3K、AKT则无明显变化(P>0.05),提示GRP78影响EMT的机制可能与SRC、smad2/3、JNK、P38、ERK等蛋白信号通路有关。smad2/3抑制剂组中,GRP78蛋白表达升高(P<0.05),提示smad2/3在激活EMT过程中与GRP78存在密切联系,结合GRP78沉默时smad2/3表达下调现象,推测smad2/3可能是GRP78下游的信号蛋白,smad2/3受抑时,导致GRP78出现负反馈性升高。在SRC抑制剂组中,P38、ERK、JNK及其磷酸化表达下降(P<0.05),而GRP78则出现升高(P<0.05),提示SRC在激活EMT过程中与GRP78存在密切联系,结合GRP78沉默时SRC表达下调现象,推测SRC可能是GRP78的另一下游信号蛋白。在P38、ERK、JNK抑制剂组中,SRC及其磷酸化蛋白表达上调(P<0.05),结合SRC受抑时,P38、ERK、JNK表达下调现象,推测P38、ERK、JNK可能是SRC的下游信号蛋白。PCR检测结果显示,在GRP78质粒转染组、smad2/3、SRC、P38、ERK以及JNK等蛋白抑制组中,Snail1、Snail2、Twist、ZEB1、ZEB2等EMT关键转录因子的表达均较缺氧模型下降(P<0.01),提示GRP78、smad2/3、SRC、P38、ERK以及JNK在缺氧微环境下细胞发生EMT的过程中发挥了重要作用。而在PI3K及AKT抑制组中,Snail1、Snail2、Twist、ZEB1、ZEB2的表达与缺氧模型组无明显差异(P>0.05)。进一步分析显示,在GRP78质粒转染组中,Snail1、Snai12、Twist、ZEB1、ZEB2的下降均较smad2/3、SRC、P38、ERK以及JJNK等蛋白抑制组明显(P<0.05)；smad2/3、SRC抑制剂组则对Snail1、Snail2、Twist、ZEB1、ZEB2的抑制均较P38、ERK、JNK等抑制组明显(P<0.05),提示沉默GRP78表达对EMT关键转录因子的影响最明显,smad2/3、SRC抑制剂组次之,与western blot提示的结果一致。动物实验结果显示,益气除痰方可抑制瘤体体积和瘤重(P<0.05),抑瘤率为27.6%,同时益气除痰方组小鼠的肺部转移结节明显低于对照组(P<0.05),提示中药可抑制肿瘤细胞生长,并可抑制体内肺癌细胞的转移。免疫组化结果显示,益气除痰方组中E-cadherin蛋白表达升高(P<0.01),而vimentin和fibronectin表达明显下降(P<0.01),提示益气除痰方在体内可抑制EMT的发生。益气除痰方组的GRP78、smad2/3、SRC、P38、ERK、JNK及其磷酸化的表达均较对照组减弱(P<0.05),推测益气除痰方体内抑制EMT的机制与抑制GRP78、smad2/3、SRC、JNK、P38以及ERK的活性有关,与细胞实验的结果推论一致。免疫组化的结果还显示,益气除痰方组PI3K、AKT及其磷酸化的表达均较对照组减弱(P<0.05),推测益气除痰方体内可能通过抑制PI3K/AKT蛋白信号通路达到抑制肿瘤生长的作用。结论：1.肺癌细胞在缺氧微环境下可发生上皮间质转化,GRP78在细胞发生EMT的过程中发挥了重要作用。2. GRP78/smad2/3以及GRP78/SRC/MAPK是缺氧微环境下引起肿瘤细胞发生EMT的重要蛋白信号通路。3.益气除痰方在体内外可抑制肿瘤细胞EMT的发生,降低癌细胞的侵袭转移能力。4.益气除痰方通过多靶点抑制GRP78/smad2/3以及GRP78/SRC/MAPK等信号通路来实现对EMT的逆转作用。