Exo-α-唾液酸苷酶:基因挖掘、转糖基作用及分子改造

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人乳寡糖(Human milk oligosaccharides,HMOs)在人乳中大量存在,具有重要的生理功能,能促进婴幼儿肠道有益菌尤其是双歧杆菌的增殖,并作为抗微生物黏附药物降低微生物感染,还能调节免疫反应等。唾液酸寡糖是人乳寡糖的重要组分,大量存在于初乳中(1-3.3g/L),其中以6’唾液酸乳糖含量最多(0.25-1.3 g/L)。该类寡糖对新生儿的益生功能显著,包括抗病原体感染、促进肠道成熟、促进免疫功能及大脑和认知发育等。尽管HMOs在人乳中大量存在,但在牛奶中含量较少。近年来,一些功能性寡糖如低聚半乳糖和低聚果糖已被作为益生元成功添加到婴幼儿配方奶粉中,但由于唾液酸独特的结构和负电性,其生理功能不能完全被其他寡糖替代,因而人工合成天然的唾液酸寡糖备受关注。目前获得唾液酸寡糖的方法主要有化学法和酶法。化学法涉及复杂的保护和去保护步骤,并且唾液酸是一个九碳酸性糖,比一般的六碳糖更加难以修饰。酶法能催化糖链一步合成,步骤简单。其中,唾液酸糖基转移酶需要十分昂贵的糖基供体(CMP-Neu5Ac)且底物选择性严格;而exo-α-唾液酸苷酶(exo-α-sialidase,EC.3.2.1.18)的底物价格大大低于糖基转移酶,且来源广,底物选择性宽泛,在规模化合成方面有一定潜力。但目前报道的α-唾液酸苷酶主要合成α2-3唾液酸寡糖,虽然有几种细菌来源的唾液酸苷酶能够合成α2-6唾液酸寡糖,但这些酶区域选择性不严格,通常会合成α2-3唾液酸寡糖同分异构体,产物难以分离,并且产物转化率低于10%,而且反应使用的商品化的糖基供体如对硝基苯唾液酸或唾液酸二糖价格仍然偏高,在一定程度上限制了该类酶的规模化应用。本论文中我们通过 CAZY 数据库(http://www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html)分析发现肠道菌中的双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)和产气芽孢梭菌(Clostridium perfringens)的基因组中存在多个预测的exo-α-唾液酸苷酶基因,可能与肠道人乳寡糖和黏膜多糖降解相关。本文中,我们运用基因挖掘技术,筛选了 7个来自肠道菌的exo-α-唾液酸苷酶,包括3个来自脆弱拟杆菌(B.fragilis)NCTC9343、3个来自产气芽孢梭菌(C.perfringens)ATCC13124和1个已知的来自双岐双岐杆菌(B.bifidum)JCM1254。对这7个不同exo-α-唾液酸苷酶进行了表达纯化、水解底物特异性实验,显示出该类酶具有广泛的底物特异性,能够水解α2-3、α2-6和α2-8各种不同键型唾液酸底物。我们以多聚唾液酸稀酸水解制备寡聚唾液酸供体,相对其它唾液酸供体具有价格更便宜、获取更方便等优点。转糖基筛选得到了一个来自脆弱拟杆菌(B.fragilis)NCTC9343的唾液酸苷酶,将其命名为BfN3,该酶具有高转糖基活性,显示出能高效合成唾液酸化人乳寡糖。酶学性质研究发现,BfN3为非离子依赖的酸性中温糖苷水解酶;BfN3单体分子量为57.9kDa,活性态分子量为113.6kDa,该酶天然状态下为二聚体;BfN3对人工底物4-甲基伞形酮唾液酸、天然底物唾液酸二糖的Km和Kcat分别为0.06 mM、283.18s—1和0.75 mM、329.64s-1。该酶能够以唾液酸二糖或寡聚唾液酸为供体,以乳糖为受体,高效发生转糖基反应形成α2-6键型,不形成其他异构体。我们详细地研究了各种反应条件,包括底物浓度(供体和受体)、pH、温度和反应时间对BfN3转糖基反应的影响,发现在以40 mM唾液酸二糖或40 mg/ml寡聚唾液酸为供体、1 M乳糖和pH 6.5的反应条件下,于50℃反应10分钟,BfN43能够特异性催化形成6’唾液酸乳糖,最大转化率超过20%。对BfN3的受体选择性进行了研究,发现该酶受体范围宽泛,能以乳糖、蜜二糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、葡萄糖多种糖受体为底物。该酶提供了一种有效的替代当前合成唾液酸寡糖的方法,显示出其巨大的理论及工业应用价值。唾液酸苷酶遵循糖苷酶反应的一般机制,反应产物可以作为底物被酶重新水解,即使优化反应条件也只能在一定范围内提高产物产量,因而我们对BfN3进行分子改造研究,以期获得高效率突变酶。首先采用了宏引物易错PCR技术对bfn3基因进行随机突变,以甲醇和乳糖为转糖基受体进行筛选,共累计筛选2457个突变酶,发现突变酶T1231效果最好,相对野生型BfN3转糖基能力(乳糖受体)提升41.5%。同时根据能高效合成α2-3唾液酸寡糖的唾液酸苷酶即克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)TcTS和布氏锥虫(Trypanosoma brucei)TbTS的结构特点,对BfN3进行理性设计,共突变11个氨基酸位点,分别为:I205L、G207A、G271V、M294Y、G295Y、W300Y、P349A、R418Y、G419Y、V448G 和 G509A。研究结果显示,11种突变酶中,G271V和G294Y突变酶酶活丧失,其余9个突变酶转糖基活性都有提升,其中以V448G、G207A、W300Y和P349A效果最为显著,以唾液酸寡糖供体、乳糖受体为底物反应时的转糖基活性比野生酶分别提高42.9%、57.2%、57.2%和64.3%。这些突变酶的获得,为唾液酸相关寡糖及糖苷化合物的合成提供了有利工具。
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