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H5亚型禽流感(Avian Influenza,AI)是由正黏RNA病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的禽类烈性、高致病性传染病,对家禽的致死率可达100%。H5亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)的自然宿主是水禽,但其宿主范围已扩大到可感染多种哺乳动物,甚至是引起人类死亡,并且随着候鸟的迁徙传播到多个洲,因此家禽H5亚型禽流感的有效防控对人类的公共卫生安全至关重要。H5亚型禽流感病毒表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin,HA)变异迅速,在遗传进化上产生很多不同的分支,近几年我国主要流行clade 2.3.4.4和clade 2.3.2.1两个分支,目前禽流感的控制主要是通过疫苗免疫,常用的疫苗分别为Re-8和Re-6灭活疫苗。H5 AIV的暴发往往是由于现有疫苗的抗原性与流行株抗原性不匹配,每当病毒抗原变异或重组,新的毒株出现时,就需要筛选新的疫苗株,这个过程耗时费力,而且几乎每隔2～5年就需要更新疫苗。因此广谱疫苗的开发成为目前流感疫苗研究的一个热点,包括设计针对流感病毒保守区域如茎部的疫苗、Mosaic疫苗等。另外,现有的商品化疫苗通常为灭活疫苗,主要刺激机体产生体液免疫应答,不同于活疫苗能同时激发机体的体液免疫和细胞免疫,而细胞免疫在机体清除流感病毒的过程中也发挥十分重要的作用,用活病毒载体表达流感病毒HA基因是流感病毒活疫苗研究的主要方向之一,比较常见的病毒载体有火鸡疱疹病毒、腺病毒、痘病毒、新城疫病毒等。因此,研制一种具有交叉保护性、又能同时激发体液和细胞免疫的疫苗具有实际意义。1 H5亚型禽流感病毒Mosaic HA基因重组转移质粒的构建参照HIV Mosaic疫苗设计原理,利用公共网站设计一条H5“mosaic”蛋白。首先下载流感病毒数据库 GISAID(http://platform.gisaid.org/epi3/frontend#48ef8b)中所有上传的H5HA序列,剔除不完整和重复的序列后比对分析并绘制遗传进化树,然后选取其中clade 2分支的基因序列翻译成氨基酸序列,上传到“Mosaic Vaccine Designer”(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/MOSAIC/makeVaccine.html),通过网站上自带的Mosaic Tool优化获得H5 Mosaic蛋白序列(H5M),并使用该网站中两个在线工具Epitope Coverage Assessment Tool(Epicover)和 Positional Epitope Coverage Assessment Tool(Posicover)预测H5M的抗原表位覆盖率。结果显示,H5M序列的表位覆盖率显著高于4 株 H5AIV 野毒株(SQ1402、YZ1111、26285 和 0520),如 H5M 对 4933 条自然毒株 HA序列的9表位长度的精确匹配率(9/9)为72.99%,8/9匹配率为92.64%,7/9匹配率为98.01%;而4株野毒株HA氨基酸序列的9表位长度的精确匹配率为56.12%～56.3%,8/9匹配率为79.33%～83.98%,7/9匹配率为92.88%～95.16%。由此可见,Mosaic序列比天然序列包含有更多的潜在抗原表位。将得到的H5M蛋白序列按照鸡源(GallusGallus)密码子优化后,合成相应的基因序列,并分别构建到含强启动子Pec和弱启动子HgB的中间质粒上。此外,分别选取当前优势流行株SQ1402(clade2.3.2.1)和YZ1111(clade 2.3.4.4)作为自然毒株序列的对照,按相同方法分别构建了含强、弱两种启动子的转移质粒。经测序、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,所构建的6个中间转移质粒均能正确表达外源目的基因。2表达H5亚型禽流感病毒Mosaic HA蛋白重组火鸡疱疹病毒的构建及免疫效力的评价利用同源重组原理,采用磷酸钙转染法将表达绿色荧光蛋白的重组火鸡疱疹病毒(rHVT-GFP)基因组DNA与上述构建好的中间转移质粒共同转染CEF细胞,经筛选、纯化和鉴定,共获得4株重组HVT,分别为rHVT-H-H5M、rHVT-P-SQ1402、rHVT-H-SQ1402、rHVT-H-YZ1111(有两个插入强启动子的质粒未能产生重组病毒)。4株重组HVT在CEF细胞上连续传15代来分析重组HVT的遗传稳定性,用IFA测定每5代重组HVT HA蛋白的表达,结果显示,所获得的4株重组HVT连续传代15代后仍能稳定表达目的蛋白。进一步评价rHVT-H-H5M疫苗对H5AIV的免疫保护效果,将4株重组疫苗rHVT-H-H5M、rHVT-P-SQ1402、rHVT-H-SQ1402 和 rHVT-H-YZ1111 分别免疫 1 日龄 SPF 鸡。在免疫后第1、2、3、4、5周采集外周血检测其HI抗体水平。在免疫后第5周,分别用H5AIV相应分支的0520(clade2.3.4.4)和Z6285(clade2.3.2.1)两个毒株对免疫组进行攻毒试验。结果表明,在相同载体、相同启动子的情况下,重组Mosaic H5病毒rHVT-H-H5M比其他自然毒株HA重组病毒rHVT-H-SQ1402、rHVT-H-YZ1111在交叉保护上显示出绝对优势,可对clade 2.3.4.4和clade 2.3.2.1产生保护,保护率分别为60%和90%。在插入相同目的片段的情况下,带有强启动子(Pec)的重组病毒rHVT-P-SQ1402比带有弱启动子(HgB)的重组病毒rHVT-H-SQ1402能诱导产生更高的抗体水平,且攻毒后更能保护鸡体。尽管rHVT-P-SQ1402对同分支(clade2.3.2.1)能提供100%的保护,但对另一分支(clade2.3.4.4)却只能提供30%的保护,只有rHVT-H-H5M能同时对两个分支能提供更高的临床保护率和显著降低排毒水平。综上所述,本研究成功地构建了一株表达Mosaic H5 HA的重组火鸡疱疹病毒载体疫苗(rHVT-H-H5M),该疫苗可对我国当前H5亚型禽流感病毒优势流行的两个分支clade 2.3.4.4和clade 2.3.2.1产生一定交叉保护效果。该研究为广谱疫苗的研制提供了一种新的思路和方法,奠定了一定的理论基础。