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铜是动物体内必需的的微量元素之一,在动物体内发挥多种营养和调控作用。无机铜在动物饲料中的生物学效价低,对环境污染严重。有机铜具有利用率高,污染小等优点,被广泛应用于畜牧生产中。酵母菌具有较强的富集微量元素的能力,经常被作为生物富集的载体,能将无机铜转化为有机铜。本实验旨在通过对产朊假丝酵母(Candida utilis)优化培养,并设置铜离子浓度梯度,确定该产朊假丝酵母最大的铜离子耐受浓度,通过传代驯化,获得富铜酵母菌种,并对铜离子富集部位和机制进行研究,为研制饲料酵母铜提供材料和数据。 主要研究如下: 为获得高密度产朊假丝酵母,作为制备富铜酵母材料。试验采用单因素试验设计与正交试验法和响应面法优化试验相结合的方法对产朊假丝酵母培养基成分(碳源、氮源、无机盐)和培养条件(装液量、转速、温度、培养时间)进行优化培养。通过测定活菌数确定最佳培养条件。结果表明:蔗糖浓度为60 g/L,酵母浸粉浓度为20 g/L,磷酸二氢钾为1 g/L,装液量45 mL,转速200 r/min,温度30℃,培养时间24 h,此时活菌数为9.32×108 CFU/mL。 利用硫酸铜做原料,设置 20 个铜离子浓度(10 μg/mL-200 μg/mL)浓度梯度,通过测定酵母菌数和铜离子转化率确定产朊假丝酵母富集铜的最佳铜离子浓度。在最佳铜离子浓度基础上,传代驯化培养产朊假丝酵母,每一代分别增加0、10、50 μg/mL铜离子浓度,使产朊假丝酵母菌最大程度吸收的铜元素,制备富铜酵母。结果表明,110 μg/mL为最佳铜离子浓度,此时菌数为 3.52×106 CFU/mL,转化率为43.81%。驯化后的酵母菌种,第一代酵母长势较好,铜离子吸附效果最佳,为 110 μg/mL驯化组,铜离子浓度为 120 μg/mL,此时菌数为2.73×106 CFU/mL,铜离子转化率为45.36%。 通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜观察产朊假丝酵母细胞表面及内部形态变化,分析驯化过程中不同铜离子浓度细胞形态以及元素含量的变化;利用能谱仪,测定细胞内外元素分布情况及含量。结果表明,铜离子能够破坏细胞表面和内部结构,导致细胞变形,耐受力变差,酵母生长变差,吸附过程中发生离子交换现象,并影响铜离子转化率;产朊假丝酵母吸附方式为胞内吸附和胞外吸附。 为了获得吸附效果最佳的富铜酵母,对富铜酵母培养基成分及培养参数进行优化培养。以转化率作为测定指标,试验采用单因素试验设计对碳源、氮源、无机盐、温度、转速和培养时间等单因素进行试验,并与 Box-Behnken 试验设计及响应面试验设计相结合的方法,确定富铜酵母最佳培养基成分和最佳培养参数,试验结果表明,蔗糖浓度 60 g/L,酵母浸粉浓度为 10 g/L ,磷酸二氢钾浓度6 g/L,转速200 r/min,温度30℃,培养时间60 h,此时转化率为56.14%。