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本论文以姜黄素诱导HaCaT细胞凋亡为基础,运用亚细胞蛋白质组学技术对HaCaT细胞凋亡前后核基质蛋白组成变化进行系统分析,发现了细胞凋亡过程中的特异核基质蛋白Prohibitin(PHB)表达下调,并以此为目标蛋白,对其在HaCaT细胞中的表达与定位及其与相关癌基因、抑癌基因产物的共定位及相互作用关系进行了研究。探索PHB在HaCaT细胞凋亡过程中的调控作用,以期能够揭示PHB在人永生化表皮HaCaT凋亡过程中的分子调控网络,从而找出深入探索表皮细胞凋亡的研究方向。
实验结果显示,经7.5mg/L姜黄素诱导处理之后,人永生化表皮HaCaT细胞的增殖活动明显受到抑制,细胞体积缩小、细胞核固缩、核内染色质凝聚;琼脂糖凝胶电泳出现细胞凋亡典型的DNA“梯状”条带;而且与细胞凋亡相关基因p53、rb、c-myc、bcl-2等表达下调,抑癌基因:fas、bax等表达上调。HaCaT细胞凋亡前后的核基质蛋白的双向电泳和质谱分析共鉴定了21种表达差异核基质蛋白,其中PHB表达下调。Western blotting实验证明,HaCaT细胞凋亡过程中PHB在核基质蛋白中表达下调而全细胞蛋白水平表达上调。激光共聚焦显微镜观察显示PHB在HaCaT细胞中分别与Fas、c-Myc、P53、Rb、Bax和Bcl-2等蛋白具有或强或弱的共定位关系,凋亡处理后其共定位区域发生了相应变化。本研究成功构建PHB原核表达载体pGEX-4T-2-phb,并在重组蛋白可溶性诱导表达及纯化基础上,利用GST pull-down实验进一步证实在HaCaT细胞中,PHB分别与c-Myc、P53和Bax有直接相互作用关系。真核表达载体pEGFP-Cl-phb的构建及真核细胞转染结果,证明了PHB在HaCaT细胞凋亡过程中的定位及其转位变化。
研究结果表明,7.5mg/L姜黄素能显著诱导人永生化表皮HaCaT细胞的凋亡,并能通过干预人永生化表皮HaCaT细胞凋亡相关基因的活性,改变多种与基因表达调控和细胞信号转导相关的重要核基质蛋白的表达,其中PHB为诱导多种细胞凋亡后出现的共同差异核基质蛋白。本研究发现PHB与凋亡相关基因bax、bcl-2、fas、p53、c-myc和rb的蛋白产物均存在不同程度的共定位关系并在HaCaT细胞凋亡过程中分别出现定位和转位变化的现象,而且GST pull-down实验证明了PHB与c-Myc、P53和Bax存在直接的相互作用关系。由此证实姜黄素诱导人永生化表皮HaCaT细胞凋亡与核基质的表达变化是密不可分的,特异核基质蛋白PHB通过与其具有相互作用关系的蛋白及相关信号通路参与HaCaT细胞的凋亡诱导调控过程。这对深入认识核基质蛋白在细胞凋亡过程中的调控机制具有重要意义。