研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease,CHD）是目前发病率和死亡率均位列我国心脏疾病之首的临床最常见的疾病之一。动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是冠心病等心血管疾病的共同病理学基础,其发病机理十分复杂,其中血脂代谢紊乱作为冠心病的一个独立危险因素。高密度脂蛋白（high density lipoprotein,HDL）是一种脂质和蛋白含量大致均等的异质性蛋白质,具有重要的心血管保护功能。近年来在血脂代谢方面研究发现单纯提高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平并不能减少冠心病发病率,也不能降低心血管事件发生率,提示HDL质（HDL功能）的改变较HDL量（HDL-C水平）更为重要。逆胆固醇转运（reverse cholesterol transport,RCT）过程是由HDL将多余的胆固醇从周围组织细胞（包括动脉粥样斑块）转运到肝脏进行机体的再循环或以胆酸的形式排泄出体外,其中巨噬细胞（macrophage）的游离胆固醇流出是RCT的第一步关键步骤。参与外周组织胆固醇外流的转运蛋白均在巨噬细胞膜表面表达。胆固醇通过RCT这一过程可以减少其在血管壁的沉积,从而阻止动脉粥样硬化的发生。血清淀粉样P物质（serum amyloid P component,SAP）最早是在淀粉样变性组织中发现,但也同样存在于血清中。SAP可以沉积于动脉粥样硬化病变部位,并且与HDL和极低密度脂蛋白（very low-density lipoprotein,VLDL）具有很高的亲和力。SAP不仅由肝细胞合成,还能由巨噬细胞合成,其能够增加胆固醇流出,从而去除细胞内胆固醇。但其中具体机制尚有待进一步研究。Psrcl（Proline/serine-richcoiled-coilprotein1）,即脯氨酸/丝氨酸丰富的卷曲螺旋蛋白1,又名DDA3,是一个编码蛋白基因,其所编码的蛋白是正常真核细胞有丝分裂进程的必要物质。Psrc1能够参与p53/TP53调节生长过程。研究发现Psrc1基因表达水平与血液中总胆固醇浓度密切相关,Psrc1基因水平升高可引起HDL-C增高,LDL-C水平降低,降低冠心病风险。以上资料提示Psrc1在HDL功能变化及动脉粥样硬化（AS）发生中可能起着重要作用,但其机制仍未阐明。研究目的以小鼠来源的RAW264.7巨噬细胞作为研究对象,运用[3H]胆固醇流出率（[3H]-cholesterol efflux rate）、表达谱 RNA 测序（Digital Gene Expression Profiling）、实时荧光定量反转录多聚核苷酸链式反应实验（quantificational real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,QRT-PCR）、蛋白免疫印迹实验（Western blot）、酶联免疫吸附剂测定（ELISA）等方法,观察SAP对巨噬细胞胆固醇转运、胆固醇转运相关蛋白、细胞粘附分子、Fcγ受体、炎症因子等的影响,应用siRNA干扰Psrc1目的基因,SAP刺激干预Psrc1-siRNA干扰的巨噬细胞后对上述指标的影响,并探讨可能的相关机制,进一步揭示SAP在胆固醇转运及炎症反应方面的作用机制,对冠心病等心血管疾病的发生发展过程补充理论依据。研究方法第一章SAP对巨噬细胞逆胆固醇转运和炎症反应的影响及相关机制探讨1、SAP对Ox-LDL诱导下RAW264.7巨噬细胞中胆固醇流出率的影响1.浓度效应:实验分组:1)空白对照组,2)SAP 1 μM组,3)SAP2.5 μM组,4)SAP 5 μM 组,5)SAP 10 μM 组;2.时间效应:实验分组:1)6h（空白对照组,SAP 1μM组,SAP 10μM组）2)24 h（空白对照组,SAP1ΜM组,SAP 10μM组）,3)48h（空白对照组,SAP 1μM组,SAP 10μM组）,4)72 h（空白对照组,SAP1μM组,SAP 10 μM 组）;通过放射性同位素标记法来检测各组样品的胆固醇流出率。2、SAP对RAW264.7巨噬细胞胆固醇转运相关蛋白表达的影响实验分组:1)空白对照组,2)SAP1μM组,3)SAP2.5μM组,4)SAP 5μM 组,5)SAP 10 μM 组;提取蛋白,通过Western blot检测脂质转运相关蛋白表达情况。3、SAP对RAW264.7巨噬细胞胆固醇转运相关蛋白mRNA表达的影响实验分组:1)空白对照组,2)SAP5 μM组;提取mRNA,逆转录为cDNA,通过QRT-PCR检测脂质转运相关蛋白mRNA表达情况。4、SAP对RAW264.7细胞粘附分子ICAM-1和细胞表面FcγRⅡb的mRNA表达水平的影响实验分组:1)空白对照组,2)SAP 5 μM组;提取mRNA,逆转录为cDNA,通过QRT-PCR检测ICAM-1和细胞表面FcγRⅡb的mRNA表达情况。5、SAP对RAW264.7巨噬细胞分泌炎症因子的影响1.浓度效应:实验分组:1)空白对照组,2)SAP1 μM组,3)SAP2.5 μM组,4)SAP 5μ 组,5)SAP 10 μ组;2.时间效应:实验分组:1)24 h浓度效应实验分组,2)48 h浓度效应实验分组,3)72 h浓度效应实验分组;留取细胞培养液上清,通过ELISA检测炎症因子IL-6、IL-10表达情况。第二章SAP对巨噬细胞基因表达谱的影响探讨1、SAP对RAW264.7细胞基因表达的影响实验分组:1)空白对照组,2)SAP 5 μM组;通过表达谱测序法来检测各组样品的差异表达基因。2、SAP对RAW264.7细胞基因表达基因本体论分析（GO）实验分组:1)空白对照组,2)SAP 5 μM组;根据两组差异表达基因,运用BiNGO软件从基因本体论（GO）功能方面去分类分析。3、SAP对RAW264.7细胞刺激后差异基因与动脉粥样硬化相关分析实验分组:1)空白对照组,2)SAP 5 μM组;根据两组差异表达基因,在Pubmed数据库中对所有差异表达基因进行系统全面的文献检索来分析相关性。4、SAP对RAW264.7细胞刺激后差异基因中非编码基因的表达变化实验分组:1)空白对照组,2)SAP 5 μ组;根据两组差异表达基因,在Pubmed数据库中对非编码基因分析。5、SAP对RAW264.7细胞刺激后基因网络关联分析实验分组:1)空白对照组,2)SAP 5μM组;根据两组差异表达基因,运用STRING网络工具分析差异基因相互关联性。第三章SAP对Psrc1-siRNA干扰的RAW264.7巨噬细胞影响胆固醇转运机制的影响探讨1、Psrc1-siRNA对RAW264.7巨噬细胞的转染效率及沉默效果的验证1.Psrc1-siRNA 序列验证:实验分组:1)空转组（NC 组）,2)Psrc1-siRNA-1组,3)Psrc1-siRNA-2 组,4)Psrc1-siRNA-3 组,5)Psrc1-siRNA-4 组;2.Psrc1-siRNA时间验证:实验分组:1)24 h Psrc1-siRNA序列验证实验分组,2)48hPsrc1-siRNA序列验证实验分组,3)72hPsrc1-siRNA序列验证实验分组,4)96hPsrc1-siRNA序列验证实验分组;3.Psrc1-siRNA 浓度验证:实验分组:1)Psrc1-siRNA-1 100nM 组,2)Psrc1-siRNA-1 50nM 组,3)Psrc1-siRNA-1 20nM 组;提取mRNA,逆转录为cDNA,通过QRT-PCR检测Psrc1表达水平。2、SAP对Ox-LDL诱导Psrc1-siRNA干扰的巨噬细胞胆固醇流出率的影响实验分组:1)空转组（NC 组）,2)空转（NC）+SAP5μ 组,3)Psrc1-siRNA组,4)Psrc1-siRNA+SAP 5 μM 组,5)正常 RAW264.7 细胞空白对照组（Normal组）6)正常 RAW264.7 细胞+SAP 5 μM 刺激干预组（Normal + SAP 5 μM组）;通过放射性同位素标记法来检测各组样品的胆固醇流出率。3、SAP对Psrc1-siRNA干扰的巨噬细胞逆胆固醇转运相关蛋白mRNA表达的影响实验分组:1)空转组（NC 组）,2)空转（NC）+ SAP 5 μM 组,3)Psrc1-siRNA组,4)Psrc1-siRNA+SAP5μM 组;提取mRNA,逆转录为cDNA,通过QRT-PCR检测胆固醇转运相关蛋白mRNA表达水平。4、SAP对Psrc1-siRNA干扰的巨噬细胞逆胆固醇转运相关蛋白水平的影响实验分组:1)空转组（NC 组）,2)空转（NC）+ SAP 5 μM 组,3)Psrc 1-siRNA组,4)Psrc1-siRNA+SAP 5 μM 组;提取蛋白,通过Western blot检测胆固醇转运相关蛋白表达情况。5、SAP对Psrc1-siRNA干扰的巨噬细胞ICAM-1和Fc γ RⅡ b表达的影响实验分组:1)空转组（NC 组）,2)空转（NC）+ SAP 5 μM 组,3)Psrc1-siRNA组,4)Psrc1-siRNA+SAP5μM 组;提取mRNA,逆转录为cDNA,通过QRT-PCR检测ICAM-1和细胞表面FcγRⅡb的mRNA表达情况。研究结果第一章SAP对巨噬细胞逆胆固醇转运和炎症反应的影响及相关机制探讨1、SAP增加Ox-LDL诱导下RAW264.7巨噬细胞中胆固醇流出率不同浓度的SAP（1、2.5、5、10μM）刺激RAW264.7细胞后,与空白对照组相比,SAP（1 μM）、SAP（2.5μM）、SAP（5μM）和 SAP（10μM）组胆固醇流出率明显升高,差异具有统计学意义（P<0.01）,以SAP（5 μM）组胆固醇流出率最高;组间差异显著（F=157.253,P=0.000）。用不同浓度的SAP（1μM和10 μM）刺激RAW264.7细胞24 h、48 h和72 h后,与空白对照组相比,两组SAP刺激的RAW细胞转出率均上升;SAP（1 μM）组胆固醇转出率在24 h、48h和72h内变化不明显,无统计学差异（P=0.76）,而SAP（10μM）组胆固醇流出率在24 h升高最明显,此后随着时间推移逐渐下降,差异具有统计学意义（P=0.011）;组间差异显著（F= 124.788,P= 0.000）。2、SAP上调RAW264.7巨噬细胞胆固醇转运相关蛋白的表达与对照组比较,SAP干预RAW细胞后ABCA1、ABCG1、SR-B Ⅰ、PPARγ、LXRα蛋白表达水平均上升;其中,在SAP（5μM）组ABCA1、ABCG1、SR-BⅠ和PPARγ蛋白表达量最高,LXRα在SAP（10 μM）组表达最高。ABCA1、ABCG1、SR-BⅠ、PPARγ、LXRα蛋白表达的组间差异也很显著。3、SAP提高RAW264.7巨噬细胞胆固醇转运相关蛋白mRNA的表达水平上一步的实验结果已经证实SAP对巨噬细胞逆胆固醇转运的影响,因此本实验采用SAP 5μ 刺激巨噬细胞24 h作为验证RAW264.7巨噬细胞胆固醇转运相关蛋白mRNA的实验条件。由此,进一步用QRT-PCR方法检测RAW264.7细胞中SAP对胆固醇转运相关蛋白ABCA1、ABCG1、SR-B Ⅰ、PPARγ、LXRαmRNA的表达水平和影响。与对照组比较,SAP干预RAW细胞后ABCA1、ABCG1、SR-BⅠ、PPARγ、LXRα的mRNA表达水平均上升,差异具有统计学意义。根据以上实验我们认为:SAP可直接上调RAW264.7细胞中ABCA1、ABCG1、SR-BⅠ、PPARγ、LXRα胆固醇代谢蛋白的mRNA水平和蛋白表达来增强逆胆固醇转运功能。4、SAP上调RAW264.7细胞粘附分子ICAM-1和细胞表面FcγRⅡ b的mRNA的表达SAP刺激干预RAW264.7巨噬细胞,设阴性对照组,同样采用SAP5μM刺激巨噬细胞24 h作为实验条件,检测炎症相关的细胞粘附分子ICAM-1和SAP结合受体FcγRⅡb的mRNA水平,对SAP在炎症反应中的作用进行初步探讨。结果显示SAP刺激干预RAW264.7细胞中ICAM-1和FcγRⅡb的mRNA表达水平均比空白对照组细胞mRNA水平升高,差异有统计学意义,（P<0.05）。5、SAP促进RAW264.7巨噬细胞炎症因子IL-6和IL-10的分泌用不同浓度的SAP（1、2.5、5、10μM）刺激RAW264.7细胞后,收集上清,与空白对照组相比,SAP各组IL-6分泌增多（P<0.05）,而以SAP（2.5 μM）、SAP（5 μM）和SAP（10 μM）组升高明显,差异具有统计学意义（P<0.01）,随着SAP浓度增加,IL-6分泌呈浓度依赖性上升趋势;用不同浓度的SAP（1、2.5、5、10μM）刺激RAW264.7细胞24h、48h、72h后收集上清,与空白对照组相比,随着时间递增各组IL-6分泌增加,IL-6分泌呈时间依赖性上升趋势;组间差异不显著。同样,用不同浓度的SAP（1、2.5、5、1lμM）刺激RAW264.7细胞后,收集上清,与空白对照组相比,SAP各组IL-10分泌亦增多（P<0.05）,而以SAP（2.5 μM）、SAP（5 μM）和SAP（10 μM）组升高明显,差异具有统计学意义（P<0.01）,随着SAP浓度增加,IL-10分泌呈浓度依赖性上升趋势;用不同浓度的 SAP（1、2.5、5、10μM）刺激 RAW264.7 细胞 24h、48h、72h 后收集上清,与空白对照组相比,随着时间递增各组IL-10分泌增加,IL-10分泌呈时间依赖性上升趋势;组间差异不显著。第二章SAP对巨噬细胞基因表达谱的影响探讨1、SAP对RAW264.7细胞基因表达的影响根据第一章SAP干预RAW264.7巨噬细胞后胆固醇流出率和胆固醇转运相关蛋白的结果,选用SAP（5μM）刺激RAW264.7细胞24h后收集细胞。通过RNA-seq测序,我们分别得到了 SAP刺激组的12 050 636个序列和空白对照组的11 651 186个序列。与空白对照组比较,SAP刺激处理组有134个基因下调和41个基因上调,下调基因倍数何上调基因倍数分别是41.01-2.00和54.14-2.01。2、SAP对RAW264.7细胞基因表达基因本体论分析（GO）所有差异表达的基因从基因本体论（GO）功能方面去分类,富集分析显示共有9个分类有显著统计学意义（P<0.05）。在生物学分类方面,生物合成过程、大分子代谢过程、核酸代谢过程、对刺激的反应和细胞死亡这5类GO分类显著富集。在细胞构成分类方面,细胞染色体和细胞核这2类GO分类显著富集。在分子功能分类方面,分子结合和核酸结合这2类显著富集。共计25个差异表达基因归在对刺激的反应这一GO分类中,包括18个下调基因（Atr,Fancm,Tnfsf15,Thbd,Tlr13,F3,Acot11,Tlr3,Ahrr,Mt1,Edn1,Rif1,Mt2,Rrm2b,1110,Lig4,Mlh3,Kin）和 7 个上调基因（Tnfsf10,H2-Ab1,Bc1,Ltb,Hspa1a,Gadd45g,Hspa1 b）。3、SAP对RAW264.7细胞刺激后差异基因与动脉粥样硬化相关分析用SAP刺激RAW264.7细胞后得到的175个差异表达基因,逐一在Pubmed数据库中对这175个差异表达基因进行系统全面的文献检索,以明确这些基因中在动脉粥样硬化领域的研究进展。用每一个基因名称,包括别名,联合“atherogenesis”或“atherosis”或“sclerosis”或“coronary heart disease”或“coronary artery disease”作为关键词检索。用上述方法检索后,得到10个蛋白编码基因,7个差异表达基因下调,3个差异表达基因上调。运用QRT-PCR验证14个蛋白编码基因,其中包括10个与动脉粥样硬化相关的基因。重复SAP刺激RAW264.7细胞实验过程,提取RNA后,QRT-PCR结果与基因表达谱测序结果相符合。4、SAP对RAW264.7细胞刺激后差异基因中非编码基因的表达变化在175个差异表达基因中包含19个非编码蛋白基因,其中包括11个长链非编码基因、4个假基因、3个snRNA前体和1个miRNA前体。运用QRT-PCR方法验证了其中9个非编码基因。QRT-PCR结果与基因表达谱测序结果相符合。SAP刺激组中,位于14号染色体短臂上的Mir17hg基因显著下调。5、SAP对RAW264.7细胞刺激后基因网络关联分析分析SAP刺激组基因相互关联性,关联其他基因数量多的基因被称为枢纽基因,在基因关联调节中起重要作用。关联分析中发现Atr,Hspa1a,Hspa1b,Mblac2和Vrk1是SAP刺激RAW264.7细胞后基因关联网中的枢纽基因。在网络关联图中也包涵了 7个与动脉粥样硬化相关的基因（Edn1 Egr1,Ppp1r3b,I110,Nlrp3,Leμr 和 Psrc1）。第三章 Psrc1在SAP对巨噬细胞逆胆固醇转运和炎症反应中作用的相关机制探讨1、Psrc1-siRNA对RAW264.7巨噬细胞的转染效率及沉默效果的验证通过第二章实验结果,我们筛选出1个经SAP刺激后差异表达上调,并且与动脉粥样硬化相关的基因——Psrc1,经过QTR-PCR验证后表达稳定,与测序结果相符。本实验所用转染方法为化学转染法,即用脂质体承载siRNA转入细胞内,是一种瞬时转染,故优化转染条件过程中,先用荧光显微镜粗略定性评估转染效率,转染1 h后,在荧光倒置显微镜下就可见到有绿色荧光的细胞约占视野下总细胞30%以上,转染3 h和6 h后荧光无明显淬灭。QRT-PCR定量检验转染效果,与阴性对照组（NC组）相比,在24h、48 h、72 h甚至96 h内,4个不同片段转染沉默的Psrc1的mRNA水平均呈低表达状态,以Psrc 1-siRNA-1（序列:ggaagaagacauaacaguatt;uacuguuaugucuucuucctt）转染效果最佳。在此基础上,用Psrc1-siRNA-1不同浓度（100nM、50nM、20nM）转染RAW巨噬细胞24h优化转染条件,3个不同浓度转染沉默巨噬细胞中的Psrc1均下降,以50nM抑制效果最佳。确定后续干扰实验均采用Psrc1-siRNA-1（序列:ggaagaagacauaacaguatt;uacuguuaugucuucuucctt）50 nM 浓度转染 24 h 为基本转染实验条件。2、SAP增加Ox-LDL诱导Psrc1-siRNA干扰的巨噬细胞胆固醇流出率根据优化转染条件的实验结果,用优化的转染条件干扰Psrc1在巨噬细胞中的表达,设置空转组（NC组）、空转（NC）+ SAP 5 μM组、Psrc1-siRNA组、Psrcl-siRNA+SAP 5 μM组、正常RAW264.7细胞空白对照组（Normal组）和正常RAW264.7细胞SAP 5μ 刺激干预组（Normal + SAP 5μ 组）,共计6个实验组。结果显示NC + SAP组和Normal + SAP组胆固醇流出率无明显统计学差异,而Psrc1-siRNA沉默组胆固醇流出率明显降低,SAP刺激后胆固醇流出率升高。3、SAP上调Psrc1-siRNA干扰的巨噬细胞逆胆固醇转运相关蛋白mRNA的表达根据优化转染条件的实验结果,设置空转组（NC组）、空转（NC）+ SAP 5μM组、Psrc1-siRNA组和Psrc1-siRNA+SAP 5 μM组,共计4个实验组检测逆胆固醇转运相关蛋白ABCA1、ABCG1、SR-B Ⅰ、PPARγ、LXRα的mRNA水平。在开始正式实验之前,对所提取样本的Psrc1基因表达进行QRT-PCR检测,验证 siRNA 干扰效果。NC + SAP 5 μM 组相较于 Psrc1-siRNA + SAP 5 μM 组,Psrc1-siRNA+SAP5 μM 组中 Psrc1、ABCA1、ABCG1、SR-B Ⅰ、PPARγ、LXRα的mRNA表达水平均下降,而Psrc1-siRNA沉默组中6个基因的mRNA表达水平均为最低,SAP刺激后mRNA表达水平可升高。4、SAP提高Psrc1-siRNA干扰的巨噬细胞逆胆固醇转运相关蛋白的表达水平根据优化转染条件的实验结果,设置空转组（NC组）、空转（NC）+ SAP 5 μM组、Psrc1-siRNA组和Psrc1-siRNA+SAP 5μM 组,共计4个实验组检测逆胆固醇转运相关蛋白水平。结果显示NC + SAP 5 μM组相较于Psrc1-siRNA +SAP 5 μ组,Psrc1-siRNA + SAP 5 P 组中 ABCA1、ABCG1、SR-B Ⅰ、PPARγ、LXRα蛋白表达水平均下降,而Psrc1-siRNA沉默组中ABCA1、ABCG1、SR-B Ⅰ、PPARγ、LXRα蛋白表达水平为最低,SAP刺激后蛋白表达水平可升高。5、SAP上调Psrc1-siRNA干扰的巨噬细胞ICAM-1和Fc γRⅡb的表达根据优化转染条件的实验结果,设置空转组（NC组）、空转（NC）+ SAP 5 μM组、Psrc1-siRNA组和Psrc1-siRNA+SAP 5 μM组,共计4个实验组检测炎症相关的细胞粘附因子ICAM-1和FcγRⅡb的mRNA水平。结果显示NC + SAP 5 μM 组相较于 Psrc1-siRNA + SAP 5 μM 组,Psrc1-siRNA + SAP 5 μM 组中ICAM-1和FcγRⅡb的mRNA表达水平均下降,而Psrc1-siRNA沉默组中ICAM-1和FcγRⅡb的mRNA表达水平均为最低,SAP刺激后mRNA表达水平可升高。研究结论1、SAP在浓度范围内（1～10μM）均可增加胆固醇流出率,提高ABCA1、ABCG1、SR B Ⅰ、PPARγ、LXRα蛋白及mRNA表达水平;2、SAP在浓度范围内（1～10 μM）可升高ICAM-1和FcγRⅡb的mRNA表达水平,促进IL-6和IL-10的分泌;3、SAP刺激干预RAW264.7细胞后,出现175个差异表达基因,其中134个基因下调,41个基因上调,还有19个差异表达的非编码蛋白基因（lncRNA）;4、175个差异表达基因GO分析显示富集在生物合成过程、大分子代谢过程、核酸代谢过程、对刺激的反应、细胞死亡、细胞染色体、细胞核、分子结合和核酸结合9类功能中5、差异表达基因中Pubmed文献报道的其中10个基因与动脉粥样硬化有关,7个差异表达基因下调（Edn1、Egr1、Ppp1r3b、Unc5b、Eef2k、Nlrp3、IL-10）,3个差异表达基因上调（Lepr、Cx3cr1、Psrc1）;6、沉默RAW264.7细胞内Psrc1表达后,胆固醇转出率下降,胆固醇转运相关蛋白ABCA1、ABCG1、SR-BⅠ、PPARγ、LXRα的mRNA表达和蛋白水平均随之下降;7、SAP刺激干预Psrc1-siRNA转染的RAW264.7细胞后,胆固醇转运相关蛋白ABCA1、ABCG1、SR-B Ⅰ、PPARγ、LXRα的mRNA表达和蛋白水平均随之增加,但均低于空转（NC）+ SAP组;8、沉默RAW264.7细胞内Psrc1表达后,下调ICAM-1和FcγRⅡb表达水平,SAP刺激干预Psrc1-siRNA转染的RAW264.7细胞后,ICAM-1和FcγRⅡb表达水平上升;9、通过本研究及已发表的文献报道我们得出结论:SAP通过部分Psrc1表达调节RAW264.7巨噬细胞的逆胆固醇转运功能。