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【研究背景与意义】自从1983年,当首例由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的艾滋病被确诊后,该病毒以惊人速度传播。一般认为,由病毒本身或其他途径破坏机体免疫应答是致病的重要原因。Bagasra等从HIV感染的临床各期病人收集精样,在较高比例(45%)的精子中,检测到HIV-1型前病毒DNA序列。Baccetti等运用免疫化学、PCR及电镜水平的原位分子杂交技术,证实HIV-1能与正常精子结合并进入其中。该研究还在HIV-1感染的病人精样中检测到病毒颗粒、病毒抗原和病毒核酸,这些精子能将HIV-1样颗粒通过受精带到正常的人卵母细胞内。这些研究结果提示可能存在HIV通过生殖细胞垂直传递的新途径。要证实这一假设,必须首先证实HIV-1基因能够整合到宿主生殖细胞的基因组中;其次要证实由精子或卵子带到胚胎细胞中的HIV-1基因能够复制和表达。因为HIV-1 gag基因编码的结构蛋白为新病毒颗粒形成所必需,而后者在HIV的致病机制中起重要作用,因此本研究对HIV-1 gag基因在小鼠卵母细胞中的整合、转录和翻译以及它被卵母细胞通过受精带进胚胎细胞后的复制、转录和翻译进行了系统的研究,目的在于为HIV-1 gag基因通过雌(女)性生殖细胞垂直传递提供实验证据。【材料与方法】重组质粒pIRES2 -EGFP-gag由本室构建。通过将其注射到小鼠卵巢转染生殖细胞来探讨HIV-1 gag基因经卵母细胞垂直传递的可能性。应用超排获得实验用卵母细胞,胚胎细胞则通过经质粒转染卵巢的雌鼠与正常雄鼠交配获得。收集显示绿色荧光的卵母细胞和胚胎,用荧光原位杂交(FISH)技术检测HIV-1 gag基因在未成熟卵母细胞间期核和成熟卵母细胞染色体上的整合以及胚胎细胞中的复制;用RT-PCR检测HIV-1 gag基因在卵母细胞与胚胎细胞中的转录;用免疫荧光技术检测HIV-1 gag基因在卵母细胞与胚胎细胞中的翻译。【结果】①重组质粒pIRES2-EGFP-gag含有HIV-1 gag前病毒DNA与绿色荧光蛋白基因,后者编码的绿色荧光蛋白可作为病毒基因表达的标记,通过观察是否显示绿色荧光,很容易鉴别卵母细胞或胚胎是否含有病毒基因;②PCR在显示绿色荧光的卵母细胞中检测到HIV-1 gag基因特异的阳性带;③FISH在未成熟卵母细胞的间期核和成熟卵母细胞的染色体上以及2-细胞胚胎的两个子细胞核上均检测到HIV-1 gag DNA的阳性信号;④RT-PCR在未成熟和成熟卵母细胞以及2-细胞胚胎中均检测到HIV-1 gag cDNA阳性条带;⑤免疫荧光在未成熟和成熟卵母细胞以及2-细胞胚胎的细胞质中检测到HIV-1 p24 gag蛋白的阳性信号。【结论】①pIRES2-EGFP-gag质粒的应用使我们很容易地选定那些含有病毒基因的卵母细胞和胚胎,节省了时间和费用并使实验结果更为准确可靠;②HIV-1 gag基因能够通过卵透明带和细胞膜并整合到卵母细胞基因组内;③携带HIV-1 gag基因的卵母细胞能完成正常的受精过程;④卵母细胞介导的HIV-1 gag基因在早期胚胎细胞中与宿主基因组同步复制并通过卵裂进入子细胞;⑤整合到卵母细胞基因组或由卵带入胚胎中的HIV-1 gag基因能在未成熟与成熟卵母细胞以及胚胎细胞中转录mRNA;⑥整合到卵母细胞基因组或由卵带入胚胎中的HIV-1 gag基因能在未成熟与成熟卵母细胞以及胚胎细胞中翻译HIV-1 p24 gag蛋白;⑦本研究为HIV-1 gag基因可经过雌性生殖细胞垂直传递给子代提供了直接的实验证据;⑧本课题是首次对HIV-1 gag基因是否经雌性生殖细胞垂直传递进行的系统研究。